T-SPPHN 002-2023 葫芦科蔬菜小西葫芦花叶病毒检测技术规程

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B15/19T/SPPHN湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN

002-2023葫芦科蔬菜小西葫芦花叶病毒检测技术规程

Detection

of

ZYMV

in

Cucurbitaceae

Vegetables2023-

11-

20

发布 实施湖南省植物保护学会 发

布学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SPPHN

002-2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载本文件是根据GB/T

《标准化工作导则

第一部分：标准的结构和起草规则》的要求编制本文件由湖南省植物保护学会归口。学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SPPHN

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本文件规定了葫芦科小西葫芦花叶病毒的病原物小西葫芦花叶病毒（Zucchini

）的反转录聚合酶链式反应（）和实时荧光定量）检测法检测鉴定的基本

3.1

Zucchini

Zucchini

3.2

先利用反转录酶将病毒的反转录成，再以为模板，在耐热聚合酶（酶）条带的出现与否判定是否存在相关病毒的一种分子生物学检测方法。3.3

兔ｗｗｗ．ｂｚｆ学兔ｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SPPHN

002-2023兔ｗｗｗ．ｂｚｆ学兔ｘｗ．ｃｏｍ标准下载先利用反转录酶将病毒的反转录成，再以为模板，然后在反应体系中加入荧

4.1

4.2

在以下的两种方法中，均需设置阳性对照和阴性对照。

根据附录、附录判定检测结果。检测结果为阳性，即判定该样品含有，该样品感染了小学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载T/SPPHN

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除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和双蒸水或去离子水或相当纯度的水。A.1.1

75%A.1.2

聚合酶，10

），2.5

），或

A.1.3

242

800

57.1

621

bp

片病叶或其他蔬菜组织叠加在一起，称取

0.1

左右至放有

粒钢珠的

灭菌离心管

60

60

1.5

10，取上清，加入

0.2

氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置

℃下

离心

10

，将

℃下

75

丢弃，室温下自然干燥

。用

20

8.0）或

ddH

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可采用一步法

试剂盒进行扩增，或者采用两步法分别进行反转录和

扩增。不同商家的试剂盒扩增反应体系和条件略有差异，操作步骤应参照相应商家的说明书进行。A.4.1

10

µL

0.4

10

0.4

µL

10

下游引物

0.4

反转录酶和

聚合酶混合液，

µL

2.8

ddH

50℃反转录

30

94

94

30

56

30

72

35

个循环；72

10

℃冰箱保存备用。A.4.2

A.4.2.1

10

µL

μL

0.5μL

10

µM

0.5μL

10mM

dNTP

mix2μL

ddH。充65

10

min

min离心数秒后

2μL

第一链合成缓冲液，

0.5μL

的反转录酶，

ddH

45℃反

70℃反

15

min

应。A.4.2.2

10μL

μL

cDNA

μL

液，0.8μL

2.5mM

dNTP

mix0.2

10

上游引物

0.2

10

µM

下游引物

0.1

6.7μL

ddH。充，进

PCR

，反94

min94℃变性

30

56℃退火

30

72℃延伸

35

个循环；72℃延伸

10

℃终止反应。

℃冰箱保存备用。

A.1.3

100

10μL

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35

621

bp

A.1

西葫芦上

ZYMV

RT-PCR

扩增产物大小应该为

621

bp

左右。阳性对照有目标条带而阴性对照无目标条带时，检测

621

bp

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反转录实时荧光定量

检测法（B.1

A.1.1

2.5

），TransStart

qPCR

B.2

194

bpB.3

B.4

A.4.2.1

20μL

0.8μL

cDNA

10μL

qPCR

0.4

µL

10

0.4

10

8.4μL

ddH