T-SDYYXH 02-2023 基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法

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C10SDYYXH T/SDYYXH

基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法A

rapid

method

for

evaluating

early

of

drugs

using

zebrafish

model 山东省医药行业协会  发

布学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载

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II

10

11

12

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022023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载 本文件按照

1.1—2020《标准化工作导则

部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定II学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载

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准备、试验步骤、保证试验有效性的条件、判定步骤、数据处理与试验报告等内容。本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性评价。

本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

39649

实验动物

实验与质量控制GB/T

21808

化学品

鱼类延长毒性14天试验GB

5749

生活饮用水卫生标准

下列术语和定义适用于本文件。3.1

纲、鲤形目、鲤科、斑马鱼属、斑马鱼种。3.2AB

AB

strain

实验室常用斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。3.3

性腺发育尚未成熟的斑马鱼。3.4

斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。3.5

periocular

斑马鱼双眼内部由于水分分布失衡，液体局部堆积使眼外围轮廓异常膨大。3.6

creatinine3.7

proteinuria尿液中的蛋白质含量增加而能够被检测到，反映肾脏滤过屏障功能情况。3.810

10%

lethal

受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。15秒内没有心跳判定为死亡。3.9

quantitative

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斑马鱼胚胎发育周期短，72hpf肾发育完成。在进化水平上，斑马鱼幼鱼的肾为前肾，仅由一nephrin基因表达量和kim1基因表达量等指标，可以评价样品的肾毒性。

5.1

非水溶性样品：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊5.2

10mg～50

30mL～505.3

a)

b)

c)

6.1

6.2

0.5

mL6.3

40

6.4

℃；温控范围：0

℃～99.9

℃。6.5

℃。6.6

6.7

6.8

试验容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受试物可能吸附于聚苯乙烯容器时，应选用惰性材料（如玻6.9

6.106.11

0.5

～50

mL。6.12

96

7.1

发育至72

hpf健康AB系斑马鱼仔鱼。斑马鱼的应用符合GB/T

39649相关规定。学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载

022023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载7.2

24

GB

5749

mmol/L

0.17

mmol/L

mmol/L

CaCl

0.16

mmol/L

MgSO

14.625

MgSO

000

mL

50

20

mL

50

980

mL

pHCaCO计）为10

mg/L～250

6.0

7.3

pH

6.5～8.0

pH

如果加入受试物后试验溶液的

pH

值小于

6.5

或大于

8.0，按照

GB/T

的相关规

pH

非水溶性受试物，添加有机溶剂、乳化剂或分散剂提高受试物溶解度和试验溶液的均匀度。受

100

8.1

试验设置空白对照组、阳性对照组和受试物组，如使用助溶剂，增设1个溶剂对照组。8.2

mL斑马鱼培养水，6孔板中每孔含50尾仔鱼和5

8.3

mL助溶剂溶液，6孔板中每孔含50尾仔鱼和5

mL助溶剂溶液。助溶剂溶液浓度为受试物组使用助溶剂的最高浓度。8.4

马兜铃酸a用助溶剂二甲基亚砜配制成2

mM储液，使用时用培养水稀释至所需浓度。随机挑取

µM马兜

mL浓度为5

µ8.5

mL受

mL受试物溶液。试验时根据需要设置多个受试物浓度组。8.6

℃的恒温光照培养箱，避光连续暴露24

h。8.7

暴露结束，将仔鱼放置载玻片，调至俯卧位，显微镜下观察仔鱼眼部形态，采集图像。8.8

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022023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载暴露结束后，收集仔鱼，加入适量体积0.9%

NaCl溶液，冰浴下充分匀浆。离心后取上清，过柱去蛋白，按试剂盒步骤检测每组样品中肌酐含量。8.9

暴露结束后，移走仔鱼，收集各组处理溶液，离心后取上清，放入层析袋内，浓缩样品溶液。各组样品中的蛋白条带。8.10

9.1

90

9.2

水溶性受试物可配制成澄清溶液，非水溶性受试物可选用二甲基亚砜、乙醇、丙酮等有机溶剂进9.3

10

10.1 10.2 10.3受试物组与空白对照组相比，斑马鱼组织肌酐水平在统计学上显著增加（P＜0.05），此时试验10.4 受试物组与空白对照组相比，斑马鱼肾病蛋白基因（nphs1）和肾损伤分子基因（havcr1）的表达量在统计学上显著增加（P＜0.05），此时试验结果可作为受试物具有肾毒性的支持证据，但不替代11

11.1

11.2

T-test

12

试验报告包含下列内容：a)

b)

c)

1)

2)

3)

4)

斑马鱼培养水特性：pH

5)

试验容器内的水质：pH

6)

d)

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