第六章 微生物代谢调控育种(4-29)

第8章推理育种8.1微生物代谢一、代谢产物的分类1、初级代谢产物分解代谢体系的酶及产物素材性生物合成体系的酶及底物结构性生物合成体系的酶及产物2、次级代谢产物根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素色素等类型。28.1.1、次级代谢产物与次级代谢调节1.初级代谢和次级代谢

初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。生存必需；始终生产；不同种，相同；环境敏感性小；酶专一。次级代谢：某些生物为避免某种代谢物积累造成不利作用而产生的一类有利生存的代谢。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素色素等类型。并非必需，但有一定价值；某一时产；不同种，不同；受环境敏影响大；酶专一性不强。8.2微生物代谢调节8.2.1次级代谢的调节机制8.2.1.1分解代谢中酶合成的调节1、酶合成的调节诱导阻遏2、酶活性的调节

直线式代谢途径中的反馈抑制；分支代谢途径中的反馈抑制：优先合成、协同反馈抑制、合作反馈抑制、累积反馈抑制、同工酶调节、顺序反馈抑制8.2.1次级代谢的调节类型①酶合成的诱导调节

有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内源、外源）为诱导剂。②反馈调节次级代谢物的自身反馈抑制和反馈阻遏

末端产物反馈调节；生产能力与抑制浓度正相关。分解代谢产物的调节

葡萄糖等一些碳、氮源及代谢产物有反馈抑制、阻遏作用。初级代谢产物的调节；

A有共用合成途径，反馈抑制；B初产物参与次合成，自反馈而影响。磷酸盐调节；

A抑制酶的作用；B导致细胞能荷变化；C竞争某些金属离子的作用。8.1.2初级代谢产物与次级代谢

一般认为，次级代谢指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物生命活动无明确功能的物质的过程，即为次级代谢产物。次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，如，糖降解过程中的乙酰CoA是合成四环素、红霉素的前体；初级代谢的调节控制1、酶合成的调节诱导阻遏2、酶活性的调节

直线式代谢途径中的反馈抑制；分支代谢途径中的反馈抑制：优先合成、协同反馈抑制、合作反馈抑制、累积反馈抑制、同工酶调节、顺序反馈抑制。298.2.2.2次级代谢产物的诱导调节1、次级代谢的诱导调节

诱导物→刺激影响初级代谢造成代谢流改变→大量生成次级代谢产物（蛋氨酸提高头孢霉素C的产量）（色氨酸提高麦解碱的产量）

诱导物→次级代谢物合成酶的合成→大量生产次级代谢产物（加入甘露聚糖诱导甘露聚糖酶合成，使甘露聚糖链霉素转化为链霉素）302、次级代谢产物的碳源分解调节3、次级代谢产物氮源分解调节4、磷酸盐的调节（直接作用和间接效应）5、细胞膜透性的调节316、次级代谢的反馈调节（1）次级代谢自身产物的反馈调节（2）分支代谢中初级代谢物的反馈调节对次级代谢的影响

次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体；初级代谢的终产物作为前体合成次级代谢产物；328.3推理（代谢调控）育种

在深入研究生物合成代谢途径以及代谢调节控制的基础理论的基础上，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累有益产物的目的。33常见的微生物代谢控制育种措施

调节体系

育种措施

诱导分解阻遏分解抑制1、组成型突变株2、抗分解调节突变株的选育●解除碳源分解调节突变株●解除氮源分解调节突变株●解除磷酸盐分解调节突变株

反馈阻遏反馈抑制3、营养缺陷型突变株4、渗漏型缺陷型突变株5、回复突变株的选育6、耐自身代谢产物的突变株7、抗终产物结构类似物的突变株8、耐前体物突变株的选育9、条件突变株的选育细胞膜渗透性10、营养缺陷型●生物素缺陷型●油酸缺陷型●甘油缺陷型11、温度敏感菌株348.3.1、组成型突变株的选育1、限量诱导物恒化培养2、循环培养3、弱诱导型底物4、诱导抑制剂5、鉴别性培养基35组成酶变异株的筛选

许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。1)

恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。

2)

循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。

将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。３、组成型突变株筛选

诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。

①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法筛选方法①加诱导酶合成抑制物如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。

②交替培养法含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。③显色反应法不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变化）——检出。

４.抗（敏感）性突变株筛选包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体

①抗生素抗性突变：提高产量；

②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；

（与噬菌体存在与否无关）③条件抗性突变：如温度，可提高产量；

（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）

④物敏突变：如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。

8.3.2抗分解调节突变株的选育8.3.3、营养缺陷型突变株的筛选及应用1、诱发突变2、中间培养3、淘汰野生型青霉素浓缩法过滤浓缩法464、营养缺陷型的检出逐个测定法夹层检出法限量补充培养基检出法影印平板法475、生长谱的确定缺陷型菌株平皿的制备缺陷营养类别的确定单一营养因素缺陷型生长因素的确定营养成分编组48营养缺陷型的应用

利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子

天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制突变型能过量生产L-赖氨酸三、抗反馈调节抗性突变株的获取及应用1、基本概念（1）什么是抗反馈调节突变株

一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。（2）抗反馈调节突变株的特点

目标产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产；52

（3）抗反馈调节的基本类型

抗馈突变型：结构基因突变使变构酶不能与代谢终产物相结合；抗阻遏突变型：调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物结合而失去阻遏作用；或操纵基因突变不能与活性阻遏蛋白结合。（4）筛选方法

浓度梯度平板法53

（2）回复突变引起的抗反馈调节株

什么是回复突变株？回复突变的基因型有哪几类？该类菌株高产的原理是什么?

如何筛选该类菌株？55（3）累积前体和耐前体突变株的选育

什么是累积前体和耐前体突变株？为什么耐前体毒性突变株可以获得高产？如何筛选耐前体突变株？56四、细胞膜透性突变株1、营养缺陷型突变株导致细胞膜透性改变；2、温度敏感突变株导致细胞膜透性改变；3、溶菌酶敏感突变株导致的细胞膜透性改变58抑制天冬氨酸中间产物Ⅰ中间产物Ⅱ高丝氨酸苏氨酸赖氨酸天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶+甲硫氨酸黄色短杆菌合成赖氨酸的途径NH4+抑制葡萄糖中间产物α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径微生物的代谢的人工控制目的

最大限度的积累对人类有用的代谢产物措施改变微生物细胞膜的通透性改变微生物的遗传特性（诱变、重组等）控制发酵条件（如温度、PH、O2等）发酵概念通过微生物的培养，大量生产各种代谢产物的过程种类1、固体发酵和液体发酵2、抗生素发酵、维生素发酵、氨基酸发酵等3、需氧发酵和厌氧发酵微生物代谢的人工控制——改变膜的透性改变细胞膜的透性，使谷氨酸迅速排放到细胞外面，解除谷氨酸的抑制作用。抑制葡萄糖中间产物α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶NH4+谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径抑制黄色短杆菌合成赖氨酸的途径天冬氨酸中间产物Ⅰ中间产物Ⅱ高丝氨酸甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶+利用诱变育种等方法，选育不能合成高丝氨酸脱氢酶的菌种用于生产.微生物代谢的人工控制——改变遗传特性O2：如：酵母菌在有氧条件下大量繁殖，在无氧条件下才大量产生酒精。又如：谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时，生成的产物是乳酸或是琥珀酸。C：N

如在谷氨酸发酵过程中，当培养基中C：N=4：1时，菌体大量繁殖而产生谷氨酸少；当C：N=3：1时，菌体繁殖受抑制而合成谷氨酸多微生物代谢的人工控制——改变发酵条件微生物的生长生长曲线时间调整期对数期稳定期衰亡期菌体数目代谢特点时间细菌数目的对数增长不明显快速增长活菌数目达到最大（K值）活菌数目急剧减少代谢活跃体积增大大量合成初级代谢产物细胞分裂速率最快个体形态、生理特征较稳定繁殖速率等于死亡速率细胞内大量积累次级代谢产物，某些细菌可形成芽孢繁殖速率小于死亡速率菌体出现多种形态（畸形），细胞解体、释放代谢产物微生物的生长生长曲线时间调整期对数期稳定期衰亡期成因应用及其他时间细菌数目的对数适应新环境适应了环境后，条件适宜、营养物质充足等营养物质消耗、有毒代谢产物积累、PH值的变化，种内斗争加剧生存条件极度恶化，有毒代谢产物积累过，生存斗争最剧烈长短与菌种、培养条件有关可作为菌种也可作科研材料制取代谢产物特别是次级产物，第8章微生物优良菌种的选育微生物发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备提纲微生物优良生产菌种的特征自然突变选育诱变选育

原理基本方法杂交育种

细菌放线菌霉菌酵母菌原生质体融合基因工程技术基因表达系统利用大肠杆菌的基因表达系统利用酵母菌的基因表达系统基因工程菌的稳定性优良菌种应具备的特征对菌种的要求

天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产

物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应具备的特征选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广，转化率高；2.产物方面：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4.设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）

一、自然选育利用微生物自然突变进行的菌种选育。原因：多因素低剂量的诱