第章免疫学检验

11三月2024第章免疫学检验第二节酶免疫检测技术1掌握酶免疫技术的基本原理32熟悉均相酶免疫测定的类型及原理掌握ELISA的原理及常用方法的类型与原理熟悉酶免疫技术检测的判定4第二节酶免疫检测技术5了解酶免疫技术常用酶及底物6了解酶免疫测定的应用酶免疫检测技术以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术

一酶免疫检测技术（EIA）定义能定性、定位、定量酶标记抗体或抗原，和待检的抗原或抗体的免疫学进行特异性反应,形成酶标物的复合物，使底物基质水解而呈色，根据呈色反应对待检的抗原抗体作出定性定量。很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。二酶免疫技术的基本原理Ag

-Ab-E(Ag-E-Ab)

S显色反应Ag(Ab)定性、定量、定位分析酶免疫基本原理Ab-E(Ag-E)

+

Ag(Ab)灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。三酶免疫技术的特点

（一）酶的要求1、酶活性要非常高；2、易标记具有抗原、抗体共价结合的基团；3、标记后不影响酶活性及抗原抗体反应性；4、酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；

四常用的酶及其底物5、产物易判定或测定6、不能对环境和人污染7、稳定，价廉、易得。（二）常用的酶

1、辣根过氧化物酶（HRP）活力高、稳定

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成。HRP的纯度用RZ表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。酶活力以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。2、碱性磷酸酶AP敏感性强稳定性差价格高3、β-Gal4、脲酶5、葡萄糖氧化酶（三）常用的底物

1、HRP的底物：四甲基联苯胺TMB蓝色邻苯二胺OPD黄色ABTS蓝绿色

2、AP的底物对硝基苯磷酸盐p-NPP黄色3、β-Gal底物甲基伞酮基-β-D-半乳糖苷（4-MUG）均相酶免疫测定定义通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

作用：一是便于观察反应结果，二是提高测定的敏感性。五酶标记抗体或抗原1、酶标记物（酶结合物）酶标记物要求：

既保有酶的催化活性；也保持了抗体（或抗原）的免疫活性；结合物尚要有良好的稳定性。

抗原要求纯度高；完全抗原抗体需要特异性好；效价高；亲合力强以及比活性较高；能批量生产；易纯化。

2、抗原和抗体以及制备方法要求单克隆抗体纯化的Ig抗体Fab技术方法简单；产率高；重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标记物稳定；不形成聚合物；

过碘酸钠法--直接法常只用于HRP标记抗体或抗原原理：酶上的醛基和抗体上的氨基形SCHIFF碱键。3、制备方法戊二醛（GA）交联法（间接法）原理：戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂。戊二醛的两个醛基分别和酶和抗体分子中的游离的氨基和酚基以共价键形式结合，形成SCHIFF键，将酶间接连在抗体分子上进行标记。

优点：标记率高；标记简单酶利用率高；标记抗体分子质量小染色效应好穿透能力强产率高抗体活性丢失少酶活丢失少

重复性好

缺点：标记方法复杂酶利用率低穿透细胞能力一般产率低抗体活性丢失较多酶活力丢失较多直接法间接法原因：酶标记溶液中含有游离的酶和酶-酶聚合物。方法：50%饱和硫酸铵沉淀，再透析凝胶过滤。4、酶标抗体结合物的纯化酶标抗体的活性酶的活性酶标物中的酶量和抗体量5、酶标抗体的鉴定加甘油低温保存5、酶标抗体结合物的保存固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面六固相载体结合抗体或抗原的容量大结合物相当广泛（亲和素生物素抗原抗体）抗体或抗原牢固地固定在其表面，相当稳定不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济1、固相载体要求2、固相载体种类塑料制品聚苯乙烯微颗粒磁珠膜载体硝酸纤维膜NC包被：将抗原或抗体结合于固相载体条件PH9.6t=37度T=4小时；t=4度过夜抗原和抗体的浓度

3、包被与封闭封闭：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清将未被抗原抗体完全覆盖的固相载体表面彻底包被，避免载体表面对其后加入的酶标抗体或抗原产生非特异性吸附，而产生假阳性显色。原因：有些没有包被，露出的聚苯乙烯，非特异性反应，本底增高。七酶免疫技术类别（1）酶免疫组化(IEH)定义：酶标记已知的抗体或者抗原，然后用酶标志的抗原或抗体与组织切片中的抗体或抗原发生反应，最后与酶底物作用发生显色反应，观察出标本中的抗原或者抗体的位置和性质，并可通过图像来分析进行定量。1、根据应用目的优势：能克服荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清缺陷，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。步骤：（1）标本的固定与保存：固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性。固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等（2）酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）3免疫染色标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。4、对照试验（control）：Positive：已知抗原阳性的切片Negative：不含已知抗原的切片空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生物素等

5结果观察染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞或间质均匀染色或更强显色定位特定，有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同无分布规律，某一程度显色片均匀着色（2）酶免疫测定(EIA)用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。（1）均相酶免疫测定(HEI)定义：抗原和抗体反应后不分离游离的酶标物体和酶标物的复合物，直接进行测定计算的方法。应用：测定小分子激素和半抗原（如药物）2、根据抗原抗体反应后是否需将酶标物的结合物和游离的酶标记物分离基本原理（竞争性）酶标记物抗原（抗体）和待检的抗原（抗体）与竞争性地相应的抗原（抗体）结合后，形成了抗原抗体复合物、酶标物的结合物、游离的酶标物三种物质。由于形成酶标物的结合物，酶的活性受到影响，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。酶活性减弱或增强+Ag-EAg-E-Ab+Ag-AbAg-E

+

Ag

+

Ab（限量）竞争酶活性↓或↑，测定总酶活性换算可得的含量AgHEI基本原理：核心竞争性结合影响酶的活性（A）酶放大免疫测定技术EMIT定义：半抗原与酶结合成酶标半抗元，保留半抗原和酶的活力。当酶标抗原和抗体结合后，所标记的酶和抗体密切接触，由于空间阻止酶的活力中心受到影响，而活性被抑制。模式1

EMIT1.Ag－E—Ab:酶活性↓（∵Ab的空间位阻，影响酶活性中心）2.游离酶(Ag-E)有酶活性基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。ES?E半抗原EMIT原理示意图：ESSEMIT

基本原理:＋

Ag竞争

Ab（限量）Ag-E正当Ag多时Ag-Ab

(多)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(少)（多）酶活性↑S当Ag少时Ag-Ab(少)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(多)（少）酶活性↓结论酶活性与Ag含量呈

相关（B）克隆酶供体免疫分析

CEDIA定义：标记了的供体酶的抗原（ED-Ag）和抗体结合后，空间位阻了供酶体和酶受体的结合，从而不能形成有活力的全酶。原理：EA1、酶ED

2、形成Ag-ED-Ab时阻止ED和EA结合，酶活降低

模式23、Ag和Ab的结合能力大于ED和EA结合CEDIA示意图总结Ag-EDEAAbAg

Ag多Ag-Ab如何变化Ag-ED-Ab如何变化Ag-ED-EA如何变化酶活如何变化结论酶的活性和样本中抗原的量正相关（C）生物素-亲和素均相酶免疫测定亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取生物素又称维生素H，存在于蛋黄中生物素和亲和素具有独特的结合特性二者可偶联抗原、抗体等大分子生物活性物质结合迅速、专一、稳定，

优势：可极大提高检测方法的灵敏度特异性强稳定性高适用范围广实验成本低BA-HEI原理要点1、Ag-A-Ab不能与B-E结合，B-E处于游离状态，保留酶的活性。2、Ag-A-B-E后酶活性丧失。模式3AgBA-HEI原理示意图：EEBSAAgAgAAgAgAEBS总结

Ag-AB-EAgAg竞争Ag-A-AbAg-AbAg多时B-E量Ag-A-B-E如何变化如何变化如何变化如何变化如何变化酶活结论酶的活性和样本中的Ag含量呈？关系应用小分子激素半抗原的测定评价优点：1.不需分离Ag-E-Ab和Ag-E；2.简便、快速、易于自动化;3.灵敏度高（10_9mol/L）,但不及异相酶免疫测定。缺点：易受内源性酶、酶抑制剂、交叉反应物影响而出现非特异性。小结酶底物标记方法EIA类型HEI模式不需要分离酶标物的结合物和游离态的酶标物共同点竞争反应中的抗体限量酶活性与待测酶标记物标记抗原抗原量抗体复合物的作用EMITCEDIABA-HEI（2）非均相酶联免疫根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分：固相酶免疫测定：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应。

液相酶免疫测定酶联免疫吸附试验(ELISA)1、酶联免疫分析技术（ELISA）

抗原（抗体）制成固相制剂，在与标本中抗原（抗体）反应后，只需经过固相的洗涤，抗原抗体复合物与其他物质的分离，再将酶标抗体（抗原）和复合物中的抗原反应，根据底物和复合物中酶的反应的颜色测定标本中的抗原的量的方法。（1）定义：

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性

2、基本原理②把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

③

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体

底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234基本原理优点：简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染固相的抗原或抗体

酶标记物（酶结合物）

酶反应的底物

三个必要试剂

3、方法类型方法：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。双抗体夹心法（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物为有色产物。根据颜色反应进行该抗原的定性或定量。双抗体夹心法示意图（4)原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（6）试剂在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）(5)应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等方法：

（1）将特异抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗体，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。竞争法如受检标本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。

（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。范围：此法可用于抗体的定量测定，也可用于测定抗原和半抗原。1.将抗原包被