SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳〔SDS〕实验目的学习SDS测定蛋白质分子量的原理掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。实验流程配胶样品制备电泳〔1.5~2h〕染色〔20min〕脱色〔30min~2h〕分析配别离胶(下胶)配浓缩胶(上胶)实验过程1.装配装置BG-verMINI型迷你垂直电泳槽(北京百晶)2.凝胶配制

实验过程*Acr有神经毒性下胶(分离胶)10%上胶(浓缩胶)5%H2O3.9ml3.4ml30%Acr-Bis3.3ml0.83mlBuffer(含SDS)(1.5MTris-ClpH8.8)2.6ml(1MTris-ClpH6.8)0.68ml10%APS200ml100mlTEMED10ml10mlTOTAL10ml5ml实验过程3.灌胶※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再参加,否那么凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,防止产生气泡.1cm下胶高度，距齿下1cmAB

水封平齐，排气泡加速聚合C弃水层凝固D灌上胶，插梳子梳需平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平参加别离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（10~20min）倒出水或正丁醇，并用加样枪/滤纸吸干制备别离胶(下胶)封水的目的是使别离胶上外表平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。别离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶(浓缩胶)样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳1.SDS2.

-mercaptoethanol

3.bromophenolblue4.GlycerolSamplebuffer样品处理ssSHSH金属浴(100℃)中15minSamplebuffer实验过程4.上样、电泳A.样品加热，上样B.电泳+〔1〕上胶恒压80V(8V/cm)〔2〕下胶恒压120V(12V/cm)加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电别离胶pH8.8加入样品上样及电泳开始电压恒定在80V，当进入别离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。StakinggelSeparatinggel电流路径

负极正极内槽外槽凝胶外槽————实验过程5.染色、脱色染色20分钟B.脱色30分钟至2小时考马斯亮兰R250蛋白质的染色方法氨基黑

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳考马斯亮兰R-250，G250

G250测定蛋白含量银染

敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳聚合原理()n()n()n()n()n+*Acr有神经毒性n决定了交联度与浓度一起决定孔径的大小过硫酸铵是催化剂TEMED是加速剂蛋白质是29：1核酸是19：1实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电荷

分子大小分子形状实验原理浓缩效应Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8Pr为什么带负电加样缓冲液二硫键盐键疏水作用氢键巯基乙醇断二硫键SDS断化学键带负电荷甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸侧链SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉溴酚兰Tris?实验原理浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速实验原理浓缩效应Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢离子的产生高的电压梯度Pr-运动加速浓缩效应实验原理分子筛效应pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-实验原理分子筛效应pH6.8主要离子氯离子甘氨酸离子(pI5.97)蛋白质离子pH8.85%10%甘氨酸解离增加无快慢离子Pr-根据分子量运动分子筛效应Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-实验原理分子筛效应pH6.8pH8.85%10%lgMw电泳迁移率lgMw=-bx+KPrMw在11.7-165Kd实验原理分子筛效应pH6.8pH8.85%10%迁移率=蛋白质移动的距离脱色后的胶长染色前胶长指示剂移动的距离实验原理迁移率=“蛋白质移动的距离”指示剂移动的距离染色前染色后蛋白质的带在哪呢？L1L2L3L4LxL1XL3L2XL4PageRulerPrestainedProteinLadder

AprestainedSDSMWmarkerwithcontrastingcoloredreferencebandsat10and70kDa.本卷须知采用此法测蛋白质分子量时，必须完全翻开二硫键。多亚基蛋白问题有些蛋白质不能用SDS测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质〔某些糖蛋白〕以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。思考题在不连续体系SDS中,当别离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?电极缓冲液中甘氨酸的作用?在不连续体系SDS中,别离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?976644292014MarkerTanon-1600数码凝胶图像分析系统GIS1D图像分析软件(Ver.4.00)诱导前后蛋白表达差异IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白〔31.9kD〕。1为诱导前，2～6分别为诱导0.5,1,1.5,2,2.5hrs。电泳过程中的不正常现象1“微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中间局部凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理方法：待其充分凝固再作后续实验。2皱眉现象由于垂直电泳槽的装置不适宜引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全处理方法：可在两板间参加适量缓冲液，以排除气泡。3“拖尾”现象样品溶解不佳引起或别离胶浓度过大解决方法：加样前离心选择适宜的样品缓冲液和凝胶缓冲液加增溶试剂降低凝胶浓度4“纹理”现象样品中的不溶性颗粒引起的解决方法：增加溶解度离心除去不溶性颗粒5偏斜现象电极放置不平行或加样位置偏斜引起6-2整块胶别离的条带太宽主要是未浓缩好的原因处理方法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确〔6.7〕；适当降低电压；6-1某一条泳道条带太宽加样量太多或者加样孔泄露引起7.“鬼带”“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端〔有时在浓缩胶中〕的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于复原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入别离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，WB反响中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理方法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充缺乏的复原剂；或可加适量EDTA来阻止复原剂的氧化。谢谢!附：蛋白质的提取与定量方法蛋白质提取不同来源，不同的方法提取原那么细胞的破碎适宜的裂解液一般在冰上进行参加适当的蛋白酶抑制剂哺乳类细胞的裂解液-RIPA50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40〔乙基苯基聚乙二醇，常用非离子性去垢剂〕,0.1%SDS蛋白酶抑制剂抑制剂靶蛋白酶PMSF苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶EDTA金属蛋白酶Leupeptin亮肽素丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin抑肽素天冬氨酸蛋白酶定量方法紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法以双缩脲为根底的方法1.BCA法bicinchoninicacid二奎啉甲酸法以双缩脲为根底的方法2.lowry法

folin酚法磷钨酸和磷钼酸钨蓝、钼蓝BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍

0.005-0.10mg/ml

Bradford法考马斯亮蓝G250染色法此法根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。与蛋白质结合后，