基因工程乙肝疫苗的制备

基因工程乙肝疫苗的制备【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。【关键词】乙肝疫苗重组质粒工艺流程1.基因工程乙肝疫苗产生背景疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB）计划免疫。92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。为了实现HB计划目标，进一步为控制全球HB做出贡献，我们必须大规模提高HB疫苗的产量和进一步提高质量。血源HB疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg生产HB疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建2.1使用重组酵母的原因使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。2.2重组酵母构建HBV只有3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重组酵母可用以下方法：目的基因分离目的基因分离重组质粒的构建（切，接）导入酵母细胞（转）培养酵母细胞（增）检测正确表达目的产物的酵母（检）（1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质粒分子切开。（切）（2）.用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。（接）（3）.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。（转）（4）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。（增）（5）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。（检）3.酵母表达的HBsAg之特性重组酵母表达的HBsAg在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为22nm的球形颗粒。这些颗粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。其氨基酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和生产了HBsAg。酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血源HBsAg类似。HBsAg比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。HBsAg表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯化。HBsAg含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。在制备血源疫苗时，可运用长时间保温法以灭活HBV。但在制备重组HBsAg时没有必要。可选用更加温和的条件。HBsAg对蛋白酶的抵抗力很强，可在pH为2的时候耐胰蛋白酶的处理。HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可进行梯度离心分离。4.疫苗的工作原理任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：（1）.将疫苗注射到人体内，疫苗通常含有已经死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一类没有感染能力的病毒蛋白，能引起机体的特异性反应。（2）.免疫系统识别出体内的外来物质（病毒和细菌），这些外来物质也被称之为抗原。（3）.一旦发现抗原，免疫系统就分泌出被称为抗体的蛋白质。这些蛋白质在血液中流动，将抗原杀死以消灭身体感染的病毒（或者与病毒蛋白质特异性结合，使之失去生物活性）。抗体是由淋巴细胞制造的。这些细胞也被称为B细胞，它的主要功能是产生能够特异性与抗原结合的抗体。（4）.人体会储存这些抗体，淋巴细胞也会有记忆这种特殊抗原的功能。所以再次染病时，它们会及时消灭此种疾病的病毒，然而抗体的针对性很强，所以曾经接种过乙肝疫苗的人，面对其他疾病时仍旧会感染（值得注意的是：当人体感染真正的病毒时，抗体会不停繁殖，直到病毒最终被消灭。而疫苗会提供数量恰到好处的抗原，以帮助人体完成识别病毒和免疫反应的过程，从而使人