第六章 RNA的合成

第六章RNA的合成核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)的合成是以DNA为模板,合成核糖核酸链,这个过程称为转录(transcription)第一节概述

DNA→RNA→蛋白质这样一个信息流中,RNA是中心环节。

DNA分子所储藏的蛋白质遗传信息,必须转变成信使RNA分子(mRNA）,才能到达蛋白质合成的工厂一核糖体,然后,蛋白质合成酶系才能把mRNA所带来的信息翻译成蛋白质。在合成蛋白质过程中,还必须有能携带氨基酸的tRNA和构成核糖体的rRNA。这三类RNA都必须以DNA为模板,在依赖于DNA的RNA聚合酶催化之下合成。

DNA→RNA→蛋白质

转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。生物体基因表达调控的第一步也就是决定是否要让该基因转录。对于大多数基因来说,这是最重要的调控机制。转录过程涉及到两个方面:一是RNA合成的酶学过程,二是RNA合成的起始信号和终止信号,也就是DNA分子上的特定序列。关于DNA和RNA的碱基序列,方向总是从5‘→3’。把作为模板转录的链称为反义链(antisensestrand)或模板链(templatestrand)。选用非模板链的序列作为有义链,其方向和核苷酸序列都与这一区域转录出来的RNA序列相一致(只是T和U的区别而已)。

●

基因表达的第一步●以D.S.DNA中的一条单链作为转录的模板●

在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下

●

模板单链DNA的方向为3’→5’,而非模板单链

DNA的方向与RNA链相同，均为5’→3’.DNA(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向)3’---TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand)template(antisensestrand)若干基本概念

●

按AU，CG配对的原则，合成RNA分子第二节RNA的结构和种类RNA与DNA的差异

DNA

RNA糖脱氧核糖核糖碱基AGCTAGCU

不含稀有碱基含稀有碱基OHOHOH5´3´RNA分子有三大类，即信使RNA(messengerRNA,mRNA)核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)转移RNA(transferRNA,tRNA)

所有这些RNA都按DNA碱基序列合成，这三类RNA结构与功能均不一样。mRNA的分子结构原核生物mRNA特征先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列5´3´顺反子顺反子顺反子插入顺序插入顺序先导区末端顺序真核生物mRNA特征：“帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+单顺反子+“尾巴”（PolyA）5´

“帽子”PolyA

3´

AAAAAAA-OHm7G-5´ppp-N-3´p单顺反子rRNA的分子结构特征：

单链，与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能。5sRNA的二级结构原核生物由5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA组成真核生物由5SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA和28SrRNA组成。tRNA的结构二级结构特征：单链三叶草叶形四臂四环三级结构特征：在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒L型第三节RNA酶促合成的特点RNA合成的基本特征

1.RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸(NTP)ATP、GTP、CTP和UTP

2.RNA链的生长方向也是从5‘→3’

3.转录必须以一条DNA链为模板,按照碱基互补的原则进行转录.A-U,C-GRNA聚合酶催化的反应ACGACGUU模板DNA5´3´5´3´新合成RNARNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段5

3

RNA

启动子（promoter)

终止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

离开第四节原核生物RNA聚合酶一、RNA聚合酶的结构E.coliRNA聚合酶由五个亚基所组成,即α2ββ‘σ。α、β、β’、σ四种亚基的分子量分别为36.5KDa、151KDa、155KDa、70KDa,整个酶分子的分子量为465KDa。有时还可以看到与RNA聚合酶相结合的一个很小的蛋白质，叫做ω亚基,其功能尚不清楚。α、β、β'、σ分别是基因rpoA、rpoB、rpoC和rpoD的产物α2ββ‘σ这样的整个酶分子称为“全酶”(

Holo-enzyme)。而σ亚基解离后的其余部分(α2ββ‘)称为核心酶(Coreenzyme)

。σ亚基的最主要的功能是识别启动子,特别是启动子上的R位点。细胞内哪条链被转录(即转录的方向),转录的起点的选择都与σ亚基有关。体外转录实验中,用全酶可得到与体内相同的结果；而用核心酶时,模板链和起始点的选择都有很大的随意性。RNApolymerase

inprok.CoreEnzymeHoloEnzyme

forelongationforinitiation依靠静电作用力依靠空间结构非专一性与DNA结合专一性与

DNA结合结合常数；1011/mol结合常数；1014/mol半衰期；60’衰期；数小时cover60bp

βααβ’δβααβ’δβ亚基可能参与底物(包括前体核苷三磷酸以及已经形成的RNA链)的结合以及催化磷酸二酯键的形成。在E.coli细胞内,某些药物能有效地抑制基因转录,如利福霉素类药物和链霉溶菌素(streptolydigin)。前者能抑制RNA合成的起始,后者能抑制RNA链的延伸。实验也表明,这两种药物均作用于β亚基。同时还发现β亚基与RNA的前体核苷三磷酸具有很高的亲和力。

α亚基可能参与全酶和启动子的牢固结合。在大肠杆菌被T4噬菌体侵染时,α亚基上的一个精氨酸发生了ADP核糖基化的修饰,从而降低了RNA聚合酶(全酶)对于寄主启动子的亲和力,而同时提高了与T4基因启动子的亲和力。这一牢固结合需要DNA双螺旋的局部解链;当RNA聚合酶核心酶沿着模板移动进行RNA链的延伸时,需要不断地在前面解开双螺旋,在后面恢复双螺旋,这些作用可能与两个α亚基的功能有关。由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点有义DNA链结合位点（β’亚基提供）

DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）双链DNA解链位点（前端α亚基提供）单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）

σ因子作用位点二、RNA聚合酶的识别功能与启动子启动子(promoter)是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢？显然启动子处的核苷酸序列具有特殊性，为了方便，人们将在DNA上开始转录的第一个碱基定为+1，沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。例：大肠杆菌启动子共有序列的功能RNA聚合酶保护法足迹法确定启动子序列

A+G,G:Maxam-Gilbertseq.marker,DNaseIpreferencecuttingforpoly(dA/dT)(a,e)Non-templatestrandlabeled,(b,c,d)Non-templatestrandlabeled对原核生物的100多个启动子的序列进行了比较后发现；在RNA转录起始点上游大约-10bp和-35bp处有两个保守的序列。在-10bp附近，有一组5’-TATAATpu的序列，这是Pribnow首先发现的称为Pribnow框，RNA聚合酶就结合在此部位上。-35bp附近，有一组5’-TTGACG-的序列；已被证实与转录起始的辨认有关，是RNA聚合酶中的δ亚基识别并结合的位置。-35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。五种E.coli启动子序列大肠杆菌启动子共有序列的功能××AGTCTTGACA××××××××××××××××××AAT××××××××××××××TTAAAT××××××AACTGT××××AAT××××××××××××××××Pribnow框-10-35识别区16-19bp5-9bp起点E.Coli各σ识别的启动子的序列全酶与启动子结合有两上明显的步骤:1)全酶发现启动子的序列并与之结合成较松弛的”封闭型”复合体.发生在-35区.2)转变成”开放型”复合体,在-10区解链,解链范围约为17bp.由于RNA聚合酶分子很大，大约能覆盖70bp的DNA序列，因此酶分子上的一个适合部位就能占据从-35到-10序列区域。

第五节原核生物RNA的酶促合成一、RNA合成的起始1.起始位点的识别

σ识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。当σ亚基发现其识别位点时,全酶就与-35序列结合(初始结合),形成一个封闭的启动子复合物。整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合,然后-10序列及起始位点处发生局部解链,一般为12bp-17bp。这时的全酶和启动子的复合物称为开放性启动子复合物。

5’3’+1转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列

Sextama

框

－10序列Pribnow框2.转录起始加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。二、链的延伸以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3´,5´-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)。σ亚基脱落后，NusA因子就结合到核心酶上，NusA因子可能在延伸和终止中发挥作用。原核生物RNApol(Core)的结构与功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrand10-17bp

三、RNA合成的终止转录终止信号有两种情况弱终止子：依赖ρ因子（终止因子，terminators）的终止。在转录终止点之前有一段回文序列。

强终止子：不依赖ρ因子（1）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。依赖ρ因子的终止：ρ因子可能结合正在合成中的RNA链的5’末端,利用水解NTP放出的能量从5'向3'方向移动。而RNA聚合酶在终止子处的较长时间的延宕给予ρ因子以追赶的机会。

不依赖ρ因子的终止

原核生物转录过程After2Nt30-50Nt/secG/C转录延宕Pausing1’-15’inTerm.δNusA第六节真核生物RNA的合成1.真核RNA聚合酶真核生物有三种RNApolymeraseI,II,III。是根椐这三种酶对α–鹅膏蕈碱（α-amanitin）的敏感性不同来区别。α-amanitin-resistantRNApolIα-amanitin-sensitiveRNApolII(lowC.)α-amanitin-sensitiveRNApolIII(highC.)真核生物中RNApol的作用必须有其他相关转录蛋白在启动子处的先期结合才能启动转录.酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件ⅠⅡⅢ核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA

snRNA50～70％20～40％10％500～700～700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度2、真核生物的启动子一般来说,真核生物启动子可定义为包括所有那些位于转录起始位点附近的序列,这些序列都是启动转录所必需的。而把识别并结合在这些序列上的蛋白因子都称为转录因子（transcriptional

factor）。这个定义没有把增强子序列包括在内，因为增强子序列可以距离转录起始位点很远，但同样也是参与启动转录的序列。（1）RNApolI的启动子RNApolI转录rRNA的基因。其启动子可分两部分：1）-40~+5称近启动子或核心启动子（corepromoter）。决定转录起始的精确位置。2）-165~-40称为远启动子或上游调控元件（upstreamcontrolelements，UCE)，影响转录的频率。启动子位于不转录的间隔区。RNAPolIpromotersinhumancellsRNApolI需要两种转录因子一个转录单位rDNA前后排列RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤分子上的N6、鸟嘌呤分子上的N2、胞嘧啶分子上的N4都是氢键供体，而腺嘌呤分子上的N7、N3，胸腺嘧啶分子上的O4、O2，鸟嘌呤分子上的N7、O6、N3和胞嘧啶分子上的O2都是氢键受体。由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实。当保守区某些碱基的取代不影响DNA上氢键的方位和特性时，启动子原有的功能保持不变；当局部DNA构象或电荷密度改变影响了这些基团的相对方位时，启动子的功能就会受到影响。（2）RNApolII的启动子真核生物RNA聚合酶II的启动子是多部位结构。它们都是由多个短的序列（元件）所构成。这些元件都在起始位点的上游。不同启动子所用的元件的种类、数目以及这些元件所处的位置都不同。RNApolII不能识别这些元件并与之结合，而是由多种转录因子分别识别并结合后，RNApolII才能结合上去启动转录。RNApolII启动子主要有四个部位（1）帽子部位，即转录起始位点。（2）TATAbox，基本上由AT碱基对所组成。（3）CAATbox，一般位于-75附近。（4）增强子（enhancer），一般都在-100以上。对转录有增强效应，主要在于增强子与起始位点的距离效应。

(5)沉寂子，使基因转录降低或关闭真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别的启动子区结构mRNA

Promoterclearance

TranscriptionstartingFEHBDA（1）远距离效应。—般位于上游-200bp处，但可增强远处启动子的转录，即使相距>10kb也能发挥作用。（2）无方向性。无论位于靶基因的上游、下游或内部都可发挥增强转录的作用。（3）顺式调节。只调节位于同一染色体上的靶基因，而对其他染色体上的基因没有作用。（4）无物种和基因的特异性。可以连接到异源基因上发挥作用。（5）具有组织特异性。在3T3细胞中，SV40的增强子比多瘤病毒的增强子要弱，但在Hela细胞中，SV40的增强子比多瘤病毒的要强5倍。增强子的效应需特定的蛋白质因子参与。（6）有相位性。其作用和DNA的构象有关。（7）有的增强子可以对外部信号产生反应。

c.ActivatorslidingEPGene-specificfactorAnactivatorbindstoanenhancerandthenslidesalongtheDNAuntilitencountersthepromoter

E

PLoopingofpromoter-enhancerregion（3）RNApolIII的启动子RNApolIII转录5SRNA和tRNA，snRNA基因。这三种RNA基因的启动子有所不同。RNApolIII的启动子大都位于转录起始位点的下游。故又称内部启动子。5SRNAtRNAsnRNA3、真核生物转录过程真核生物的转录机制十分复杂，有三种RNApolE，每一种都有不同的启动子。每一个启动子又有不同的转录因子识别和结合，目前均在分门别类的研究之中。一般认为，真核生物转录的基本过程与原核生物类似，但在起始，延伸和终止过程中会有更复杂的机制。第六节转录产物的加工在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primarytranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5

和3

末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。

几乎所有mRNA都可以被分为3部分：编码区和位于AUG之前的5′端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3′端下游非编码区。编码区从起始密码子AUG开始经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。对于第一个顺反子来说，一旦mRNA的5′端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。我们把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA(monocistronicmRNA)，把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA(polycistronicmRNA)。

（1）真核mRNA前体的加工剪接（Splicing）

去除内含子，连接外显子5’帽端结构的生成（如图）3’端多聚A（polyA）的附加由RNA末端腺苷酸转移酶催化mRNA5′端加“G”的反应是由腺苷酸转移酶完成的，帽子结构可能使mRNA免遭核酸酶的破坏。而且，有帽子结构的mRNA更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。

除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3′端都有polyA序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个左右。加polyA时需要由内切酶切开mRNA3‘端的特定部位，然后由polyA合成酶催化多聚腺苷酸的反应。PolyA是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。

真核生物mRNA分子的3′端加polyA反应（2）rRNA前体的加工

rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。

加工过程：

1、剪切作用：需核酸酶参与。

2、甲基化修饰：修饰在碱基上。

3、自我剪接：一种核酶的作用。

原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA

真核rRNA加工：

1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。

2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。大肠杆菌rRNA前体加工真核生物rRNA前体加工（3）tRNA前体的加工tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子3’末端加上CCA

碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用常见tRNA中的修饰核苷酸

Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U（5-甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U（5-甲基-2硫代尿苷）K2C（2-赖氨酸胞苷）Com5U（5(2)-羟羧甲基尿苷）I（Inosine次黄嘌呤）m7G(7-甲基尿苷)m5C（5-甲基胞苷）m6A（6-甲基腺苷）s2C（2-硫代胞苷）ψ(假尿苷）Um(2’-O-甲基尿苷)Q（Queuosine）

Xo5U(5-羟基尿苷)

OHOHNHCH2

H2NR

第七节RNA的剪切机制真核生物一个基因的外显子和内含子都转录在一条原初转录本RNA分子中，然后把内含子切除，把外显子连接起来，才能产生成熟的RNA分子，这个过程就叫RNA剪接（RNAsplicing）。（1）RNA的自我剪接与核酶1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，证实RNA有催化作用，把这种具有催化作用的RNA分子命名为ribozyme，译作核酶。invivoNuclearincubation

414Nt(circleRNA)

continueincubationsameresultsGTP/GDP/GMPinvitropre-35srRNA35srRNA414Nt(linearRNA)

(noanyenzyme&energy)

这一实验表明一种RNA分子具有高度专一的催化活性，并且在无蛋白质情况下能进行自我剪切。后来证明所有辅助因子为一鸟苷单元（GTP，GDP，GMP），G不作为能源而是作为攻击基团。G结合到RNA中，然后攻击内含子5’-末端形成磷酸二酯键。这种转酯化作用在内含子5’-末端生成一3’-OH，然后这个3’-OH攻击内含子3’剪切部位，这第二次转酯化反应将两个外显子连接起来并导致414nt的内含子释放。在这一步中含有G的一个15核苷酸片段被切除，所形成的399个核苷酸环打开，形成一个线型分子，然后失去4个核苷酸片段，形成一个环状结构，最后此环状物打开成一线型RNA，称为L19RNA（因为些内含子共失去19个核苷酸序列）。invitropre-35srRNA

GMP32~414Ntintron

GTPα32

Lose19Nt+399Ntcircleintron4Nt+395NtlinearintronGMP32~15Nt

(L19)重要推测35srRNAauto-splicingwithL19asRibozyme

pApUAUtrans-esterification414162041420+4Nt395NtG+15NtL19aspolymeraseofpoly(C)3‘-G-OHGGGAGGpCCCCC-OHGGGAGGpCCCCC-OH3‘-G-OH3‘-GC-OHGGGAGGpCCCCCC-OH3‘-GGGGAGGC-OH3‘G-OHGGGAGGHO-CCCCpHO-CCCCCCp

●

Intron

的剪接经过3次转酯反应

1th414Nt

2ed15+399Nt3rd4+395Nt(L19)

剪接过程不需任何酶类与能量的参与●GMP通过转酯（trans-esterification）方式进入Intron可见L19确实是个真酶，它即是一个核酸酶，也是一个聚合酶。生物学意义；发展了具有催化功能的大分子种类

分子进化理论的发展RNA是原始生命中最早具有催化功能（切割，连接）的酶活性物质？！RNA是原始生命中最早具有遗传信息载体功能的物质，可自我复制（2）蛋白质（酶）参与的剪接内含子主要在tRNA前体中发现。RNAaseP：RNAaseP是一种内切核酸酶。所有的tRNA5‘末端都是由该酶产生的。RNAaseD：为外切核酸酶,作用于tRNA末端多余的核苷酸,直到CCA序列为止。

RNAaseⅢ以及相关的酶：这些内切酶负责切开基因之间的间隔子序列。(3)mRNA前体剪接__snRNP催化的剪接mRNA前体的内含子必须精确的剪接掉,如果多剪接或少剪接掉一个核苷酸,就使得密码子改变了,从而合成出一个完全不同的氨基酸序列。一些遗传性疾病,就是由于异常剪接造成的。真核生物基因的初始转录产物（mRNA前体）不仅要进行5＇端的帽子结构和3＇端poly（A）尾巴的合成，还必须进行内含子的剪接后才能成为成熟的mRNA，从而运输到细胞质中进行翻译。对于剪接反应来说，最主要的问题是要保证剪接反应的准确性。mRNA前体的剪接与三段保守序列密切相关，这些序列结构可能提供识别信号进行正确的剪接。这三段保守序列分别位于内含子的起点边界（5＇端剪接位点）、末端边界（3＇端剪接位点）和分支位点。多数mRNA前体内含子的两端序列高度保守，5＇端剪接位点边界序列为GU，3＇端剪接位点边界序列为AG，常常把这种特征性序列结构称为GU-AG规则。5’---E1---AAUAGGUGA--------I1-----UACAGGUUG---E2-----E2--CUCAGGUACA-------I2-------UCAGGUUG---E3-----E3-------CCAGUAA---------I3-----UACAGGAA------E4-----E4-------AUGGUAA--------14-------AAAGGU--------E5-----E5-------GAGGUAUAU----I5-------CCAGCAA------E6-----E6-----GCAGGUAUGG---I6-------GCAGCUU-----E7---3’●

Intron与Exon的连接处存在部分同源的consensusseq.OvalbuminmRNA(6Intron,7Exon)Chambonruled)GroupIIIsplicingmodel(Chambon)JunctionsequenceChambonrule●5’---exon---GU--------intron--------AG------exon----3’供点100%94%受点●7Ntbranchsiteinupstreamof3’junctionseq.pyXpyUpuApy真核生物的细胞中,有许多100碱基～300碱基的小分子RNA,在核中的小RNA叫做snRNA,在细胞质中的叫scRNA。一般情况下它们都是以核蛋白形式存在的,即snRNP(snrnps)和scRNP(scrnps)。在各种snRNA中,只有U1snRNA的5'端序列能够与mRNA前体的两个拼接点序列互补。在真核生物核mRNA前体的拼接体中,除了U1snRNP之外,还发现其他种类的snRNP：U2snRNP,Ｕ5snRNP,U4/U6snRNP。迄今为止,人们并没有发现