2023-2024届高考一轮复习生物学案（人教版）第十单元生物技术与工程第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序

第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序

【课标要求】1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三

种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载

体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤,

进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴

定，或运用软件进行虚拟PCR实验。

考点一重组DNA技术的基本工具

■归纳夯实必备知识

I.基因工程的概念

别名重组DNA技术

操作环境生物体外

操作对象Ss

操作水平DNA分子水平

结果创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品

2.基因工程的诞生和发展

(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质,还证明了DNA可在同种生物不同个体之

间转移。

(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。

(3)中心法则的确立。

(4)遗传密码的破译。

(5)基因转移载体和限制醐、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基

因的获得创造了条件。

(6)DNA体外重组的实现。

(7)重组DNA表达实验的成功。

(8)DNA测序和合成技术的发明。

(9)PCR技术的发明。

(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。

3.重组DNA技术的基本工具

(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)

陋主要来白原核生物

理箜分离的限制酶有数千种

识别双链DNA分子的特定核甘酸序列

限特点

制使每一条链中特定部位的磷酸二酯

酶(专一性)

键断开

—断开两个核甘酸之间的磷酸二酯键

结果

—产生黏性末端和平末端

(2)DNA连接酶

作用将双链DNA片段“缝合”起来.恢复被限制

一幅切开的两个核背酸之间的磷酸二酯键

DNA

连产一大肠杆菌

接E.coliDNA

遮一只“缝合”黏性末端

陶连接醯

类型

「来源.T4噬菌体

T4DNA

连接酶功能一“缝合”黏性末端和平

末端

(3)载体

种类一质粒(常用载体):环状双链DNA分子

-噬菌体、动植物病毒等

有一个至多个限制酶切割位点

携带外源DNA片段的质粒进入受体细

a特点胞后，能在细胞中进行自我复制,或整

体

合到受体DNA上,随受体DNA同步复制

常有特殊的标记基因,便于重组DNA

分子的筛选___________________________

姆携带外源DNA片段进入受体细胞

•教材隐性知识

(1)源于选择性必修3P7i“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？

提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。

②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？

提示原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

(2)源于选择性必修3P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶丕是(填“是"或"不是”)

一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核

昔酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA

连接酶不需要模板。

【延伸应用】图解限制酶的选择原则

标记基因PStl

PstISmaIPstI

EcoRI

SmaI抗病ECORI

基因

甲乙

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PSfI,而不选择SmaI。

(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以

所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SwI。

(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstI；

为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，

如图甲也可选择PstI和EcoRI两种限制酶。

■拓展提升科学思维

构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。

GGATCC目的基因GATC

IIlIIIl「IIIIIIII

CCTAGGCTAG

(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶I和限制性内切核酸酶∏切割后形成黏性末端的过程。

提示限制性内切核酸酶I：

-GGATCC—-GGATCC-

—CCTAGG-f—CCTAG—G-

t

限制性内切核酸酶II：

I

-GATC—-GATC-

-CTAG-―—CTAG+

t

(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。

提示用限制酶∏切割目的基因，用限制酶I切割质粒。

限制酶I的识别序列包含限制酶∏的识别序列，因此限制酶II也可切割限制酶I的位点，故

使用限制酶II时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶

1［切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶I切割质粒。

■突破

I.下表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法

错误的是（）

限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点

BamHIG1GATCCKpnIGGTAC1C

EcoRICtAATTCSaU3AIGATC

HindIIGTY*RACStnaICCCGGG

注：Y为C或T,R为A或G。

A.Hindɪɪ,Smai两种限制酶切割后形成平末端

B.Sau-iX【限制前的切割位点在识别序列的外部

C.BamHI和Sau3A1两种限制酶切割后形成相同的黏性末端

D.一种限制酶一定只能识别一种核甘酸序列

答案D

解析HindII、SmaI两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；SaU3AI

限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHI限制酶识别GGATCC

序列，S〃〃3AI限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC,C正确；Hind∏

能识别GTCAAC,也能识别GTTAAC,D错误。

2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是（）

A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子

B.在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点

C.携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制

D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择

答案D

解析质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布；并不是所有的

质粒上都有限制酶的切割位点，从而成为合适的运载目的基因的工具；重组质粒进入受体细

胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制。

【归纳提升】与DNA有关的几种酶的比较

I作用底物;［作用部位］1作用结果；

'^^Γ^^

磷酸将DNA切成两个或

二酯键多个片段

磷酸将两个DNA片段连

二酯键接为一个DNA分子

以DNA单链为模板，

磷酸将单个脱氧核昔酸依

二酯键次连接到单链末端

将双链分子局

碱基对中DNA

部解旋为单链，形

的氢键

成两条长链

磷酸将DNA片段水解为

二酯键单个脱氧核昔酸

考点二基因工程的基本操作程序

・归纳夯实必备知识

1.目的基因的筛选与获取

(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的

基因。

(2)筛选合适的目的基因

①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。

(3)目的基因的获取

①人工合成目的基因。

②PCR获里和扩增目的基因

a.PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制

的各种组分与反应条件,对目的基因的核昔酸序列进行大量复制的技术。

b.PCR反应的条件：一定的缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核反酸、耐高温的

DNA聚合酶，以及能自动调控温度的仪器。

c.PCR扩增的过程

当温度超过型1C时，双链DNA解聚为

［岑性)—

单链_________________________________

当温度F降到50七左右时，两种用物通

S—过碱基互补配对与两条单链DNA结合

当温度上升到这七左右时,溶液中的4种

脱氧核甘酸在耐高温的DNA聚合酶的作

恒⅛—用下，根据碱基互补配对原则合成新的

DNA链_______________________________

d.PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。

③通过构建基因文库来获取目的基因。

•教材隐性知识

(1)源于选择性必修3P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠

道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也无特异性受体。因

此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。

(2)源于选择性必修3P77“相关信息”：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。

因此，PeR反应缓冲溶液中一般要添加Mg?+。引物是一，卜段能与DNA母链的一段碱基序列

互补配对的短单链核酸。

2.基因表达载体的构建——基因工程的核心

(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,同时，使目的基因能

够表达和发挥作用。

(2)基因表达载体的组成及作用

目的基因：编码蛋白质的基因或具有调

控作用的因子

(/表达载9J启动子：RNA聚合幅识别和结合的部

改复制原点从位；能驱动基因转录出mRNA

弋终止子：转录的终点，在转录过程中

起调控作用

标记基因:供重组DNA分子的筛选

(3)构建过程

质粒DNA分子

同一种限制酶或能产生相同

末端的限制酶切割

Z----------------------------------------------------------S

一个切口；两个黏性末端两个切口；获得目的基因

IDNAiiiKIW

重组DNA分子(重组质粒)

【提醒】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

项目启动子终止子起始密码子终止密码子

本质DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶识别和

使转录在所需要翻译的起始信号翻译的结束信号

功能结合的部位，驱动基

的地方停下来(编码氨基酸)(不编码氨基酸)

因转录出mRNA

3.将目的基因导入受体细胞

生物种类植物动物微生物

农杆菌转化法、花粉管通

常用方法显微注射法Ca?’处理法

道法

受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞

将目的基因插入Ti质粒的将含有目的基因的表

Ca?*处理细胞一细胞处于

T-DNA中f农杆菌f导达载体提纯f取卵(受

一种能吸收周围环境中

转化过程入植物细胞一整合到受体精卵)一显微注射f受

DNA分子的生理状态一基

细胞的染色体DNA上f精卵发育一获得具有

因表达载体导入

表达新性状的动物

【辨析】(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此

处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。

(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目

的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA±；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒

导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

4.目的基因的检测与鉴定

分子水平检测个体生物学

水平鉴定

■拓展提升科学思维

PCR是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,

对目的基因的核甘酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关

引物的问题：

(1)什么是引物？

提示引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。

(2)PCR技术为什么需要引物？

提示DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3'端延伸DNA链。

(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？

提示目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。

(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是

什么？

提示两种引物之间不能互补配对。

(5)为检测胚乳细胞中Wt基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA,经逆转录过程获得

总cDNA,通过PCR技术可在总CDNA中专一性地扩增出WV基因的cDNA,原因是什么？

提示引物是依据%基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与皿r基因的CDNA特异性

结合)。

(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要

消耗多少个引物数？

提示经过〃轮循环需要消耗引物数为(2.1—2)个，第〃轮循环需要消耗的引物数为2"个。

■突破强化关键能力

3.(2023•湖北宜昌高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变

化。单核甘酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，

第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是()

诱变引物

♦A

第一轮PCRl-

_PCR产物用作］大引物

第二轮PCR∣

A.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启

动子、终止子等结构才能进行转录和翻译

B.单核甘酸的定点诱变所属变异类型为基因突变

C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链

D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程

答案C

解析单核苔酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B正确；除了第一轮产物作第二轮PCR

扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，

C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改

造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结

构改变属于蛋白质工程，D正确。

4.下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是（）

A.过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与

B.过程B需要用CaCI2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性

C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达

D.转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定

答案D

解析题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA

聚合酶，A错误；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞细胞膜的通透性，B错误；抗植物病毒基因

整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成功

可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染来进行鉴定，D正确。

【归纳提升】（I）PCR技术和DNA复制的比较

（PCR技术）（DNA复制）

体外（PCR扩增r-ɔ细胞内（主要是

仪中）-细胞核内）

DNA在高温下—解旋

解旋酶催化

变性解旋方式

I解漆酹

耐高温的DNA聚合酶T^>~DNA聚合酶

在较高温度下进_

温度一细胞内温和条件

行，需控制温度一

条件

DNA片段T合成对象〕一DNA分子

（相同点）

均需要模板（DNA双链）、原料

（四种脱氧核甘酸）、能量

（2）PCR扩增过程中的循环图示与规律

UIJiJLllllIIlI⅛⅛73,

5⅛∣τ∣τιι,ιππ^πg⅛∙;;

ʒ,'snɪɪŋɜ*

5,

3，.・・

一WMnllHI

飙皿∏∏∏∏∏∏］唱

[Hni吧L

3,∙∙2⅞∏∏理哼,

3，.士：Gtnnnn皿啖，

,5,aτ≡πιπππr⅞>

33

一目标序列∙^H∏H0"y

一例,序列ʒ:ŋnn^-ɪ

ɜ:

口引物A循环3：5

口引物B循环1：循环2：

变性-复性-延伸变性-复性-延伸变性-复性f延伸

循环次数123n

DNA分子数2482n

含引物A(或B)的

1372n-l

DNA分子数

同时含引物A、B

0=21-22=22-26=23-22”一2

的DNA分子数

共消耗的引物数量2=2LI—26=22+l-214=23+l-22〃+ɪ—2

考点三DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴

定

■归纳

1.DNA的粗提取与鉴定

(1)基本原理

DNA不溶于酒精,某些蛋初步分离DNA

白质溶于酒精的蛋白质

DNA能溶于物质的量浓度

溶解DNA

为2mol∕L的NaCI溶液

一定温度下，DNA遇二苯

鉴定DNA

胺试剂呈现蓝色

(2)操作流程

(取材、研磨)

在漏斗中垫上纱布，将研磨液过

滤到烧杯中，在4七冰箱中放置

去除滤液中

几分钟后(或宜接将研磨液倒入

杂质

塑料离心管中，离心5min),再

取上清液

,在上清液中加入等体积的、预冷

的体积分数为95⅜的酒精溶液.

-------一J静置2~3min,用玻璃棒沿一个

DNA的析出Jj方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸

吸去上面的水分(或将溶液倒入

塑料离心管中,离心5min,弃上清

.液.将管底的沉淀物晾干)

■将丝状物或沉淀物用2mol/L的

..........——ɔNaCl溶液溶解,然后加入二苯

f[DNAf⅛‹J⅛∕EJ胺试剂，混匀后置于沸水中加

.热5min,冷却后观察颜色变化

【注意】加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA

分子不能形成絮状沉淀。

2.DNA片段的扩增及电泳鉴定

(1)实验基础

①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。

②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，

这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。

③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓

度、DNA分子的大小和构象等有关。

(2)PCR实验操作步骤

言注_用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的

电/说明书，向微量离心管中依次加入各组分

f⅛A盖严胤R堂的盖子

偏、_将微量离心管放在离心机里，离心约10s,

也半厂使反应液集中在管的底部

kLL设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液

盛㈣-的微量离心管放在PCR仪中进行反应

(3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检

测出来。

■拓展提升科学思维

1.在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪些？

提示（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸僧水等

在使用前必须进行高压灭菌处理。（2）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后,

移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。（3）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

2.如何来评价扩增的效果？

提示观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

■突破强化关键能力

5.（2023•江苏苏州高三期末）下列以洋葱为实验材料进行uDNA的粗提取与鉴定”实验的叙

述，正确的是（）

A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量

B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加

C.向含DNA的滤液中加入2mol/L的NaCI溶液有利于去除杂质

D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化

答案D

解析洋葱研磨液要用纱布过滤，A错误；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精

中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA,但提取量不变，B错

误；向含DNA的滤液中加入预冷的酒精溶液有利于去除杂质，加入2mol/L的NaCl溶液是

溶解粗提取的DNA,C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试

剂鉴定DNA时，需沸水浴加热，冷却后再观察颜色变化，D正确。

6.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的

是（）

各加4mL二苯胺试剂

图1图2

A.选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞

B.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显

C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精

D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色

答案D

解析图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2

中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为

2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂不会出现蓝色，而DNA遇二苯胺试剂出现蓝色，D错误。

重温高考真题演练

1.（2021∙湖北，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物

与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条

带的产生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

答案D

解析增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延

长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，

故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C错误。

2.（2019∙江苏，10）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（）

A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近

B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂

C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA

D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热

答案A

解析哺乳动物（如兔）成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA,故兔血不

宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔

且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，

预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA,C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯

胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。

3.（202。北京，12）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属

转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基

因杨树苗中是否含有导入的43基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩

增时，应选择的引物组合是（）

⑪

左父1比I界

二③.

杨树内源—杨树内源

启

、终

DNA动’HMA3DNA

止

子基因

)子

苍瓦

孰

（注：①、C④表示引移)

A.①+③B.①+②

C.③+②D.③+④

答案B

解析引物①扩增的片段含有启动子和HM43基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②

扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HAM3)

基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有

导入的H历43基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和，MA3基因序列，应

选择的引物组合是①+②，B正确。

4.(2022∙江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究

纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：

(1)纤毛结构如图I所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由

中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是

(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X

进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋

白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至mol/L的目的是.

PCR扩增时，需在______________催化下，在引物端进行DNA链的延伸，获得

扩增产物用于测序。

(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具

有绿色荧光,可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Il所示载体质粒Y,

构建Y-M重组质粒(在ECoRV位点插入片段)。请完成下表。

限制酶识别序列

BamHIG1GATCC

EeORVGAT1ATC

HEdIUA1AGCTT

BginA1GATCT

23Y-M连接处测序后部分序列

编号___________________________

Ql5,∙∙AGATCTCCGATATT……3'

Q25,-AGATCTCCAACCTT……3'

Q35,∙∙AAGCTTCCGGATCC……3'

Q45,…AAGCTTCCGATATC……3'

图Ill

分步实验目标简易操作、结果、分析

PCR鉴定正向重组质粒Y—M（图∏中融合①诜择图∏引物：一

片段M中有白色的箭头，代表方向）②PCR目的产物约为__________bp

确保M及连接处序列正确，Y-M的连接

③质粒测序，图III中正确的是_________（选填

处上游含有HindIII+EcoRV的识别序列，

序列编号）

下游含有&oRV+BanHI的识别序列

④对照质粒Y—GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y

-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有

检测融合蛋白定位绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明

（4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z

的转录水平。采集样本、提取总RNA,经形成CDNA作为模板，PCR扩增结

果显示，在总CDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15,而病人Ct值为20（Ct值是产

物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物

中，健康人样品的目的产物大约是病人的倍。

答案（1）磷脂、蛋白质发出星射线，形成纺锤体（2）溶解DNA耐高温DNA聚合酶

（ThqDNA聚合酶）3,（3）a、b1100Q3X蛋白参与中心体的形成（4）逆转录32

解析（2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出

来，DNA在mol∕L的NaCI溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会

下降，因此实验过程中添加Nael至mol∕L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在7⅛qDNA

聚合酶的催化下，在引物的3'端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。（3）PCR扩

增目的DNA片段时，在引物的3'端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图∏中的引物

a和引物b,PCR目的产物约为300+800=1100（bp）o为确保M及连接处序列正确，Y-M

的连接处上游含有小"dΠI+EcoRV的识别序列，下游含有£：CoRV+BamHI的识别序列，

根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRV位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序

列应含有Hi"dl∏和BamHI识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒

Y-GFP（仅表达GFP）与实脸质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，

而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。⑷研究另一纤毛病相关基

因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、

提取总RNA,经逆转录形成CDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总CDNA模板量相等

的条件下，健康人Ct值为15,而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR

循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的CDNA数为X,病人Z基因的CDNA

数为y,则有χX2"=yX220,从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品

的目的产物大约是病人的25=32（倍）。

五分钟查落实

1.判断关于基因工程的基本