50鸡新城疫检测

《养禽与禽病防控技术》

课程负责人：朝克图

鸡新城疫血凝和血凝抑制抗体水平检测主讲人：包成林重点实训实训目的掌握鸡新城疫血凝和血凝抑制抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。原理

某些病毒能够与动物的红细胞发生凝集，此为红细胞凝集现象，鸡新城疫病毒就可以与鸡红细胞发生凝集现象。

这种红细胞凝集现象可与病毒血液中加入特异免疫血清所抑制，免疫血清中抗体先一步与抗原结合，就没有多余的抗原与红细胞结合了，即为红细胞凝集抑制实验。仪器设备动物：健康成鸡2到5只，被检鸡15到25只。器材：高压灭菌器，滤纸，试管，试管架，离心机，离心管，内径两毫米聚乙烯塑料管，96孔微型微量凝集实验板，0.0025mm微量吸液器，微型振荡器，脱脂棉等。药剂：浓缩抗原,生理盐水,缓冲盐水，细胞保存液，红细胞悬液，待检血清。实训步骤一、抽血。

抽取鸡翅根静脉血3.2毫升与0.8毫升的抗凝剂充分混合。配置1%鸡红细胞悬液。二、红细胞血凝实验。

在96孔微型微量血凝板三排，1~12孔均加入25ulpbs。将抗原或病毒悬液在反应板上进行系列倍比稀释，依次进行贝比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25ul，弃去第12孔不加抗原或病毒悬液作为pbs对照。再在每孔加入25毫升pbs。最后每孔加入25ul体积分数为1%的肌红细胞血液，将微量反应板在微型振荡器振荡混匀，室温静置20分钟到30分钟，当对照孔红细胞呈显纽扣状时，可进行结果判定。将反应板倾斜，观察红细胞有无泪珠状流淌，已完全凝结的最高稀释倍数为抗原或病毒血液的血凝效价，完全凝结的病毒最高稀释倍数为一个血凝单位。三、血凝抑制实验。

根据测得抗原或病毒悬液血凝效价配制四单位抗原。

取96孔微型微量血凝板，用一液器在三排第一孔至第11孔各加入25ulpbs第12孔加入50ulpbs。在第一孔加入25ul血清充分混匀后，倍比稀释，从第10孔弃出25ul。然后在第一孔至第11孔各加入25ul四单位病毒震荡15秒，使液体充分混匀，室温静置20分钟到30分钟。最后在第一孔到第12孔加入25ul1%的鸡红细胞，悬液震荡混匀，室温静置20分钟到40分钟，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。稍作等待后，以第11款为抗原对照，第12孔为对照，每次测定还应设已知效价的标准，阳性血清和阴性血清做对照。

结果判定时将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕流淌，以完全抑制四单位病毒的最高血清稀释倍数，为该血清的抗体效价。注意事项1、制作1%红细胞悬液所采用的鸡，应为未接种过新城疫疫苗的健康鸡。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。2、每加一种样品都要换一个移液器的滴头，以影响实验结果。3、1%红细胞悬液4°C保存，使用时轻轻摇匀，做同一次实验或测同一批样品不能更换更换红细胞，正常保存3天的红细胞不影响实验结果。4、温度对试验结果也有影响，一般要求在室温25~37℃进行实验，当温度低于4°C时红细胞有时会发生自凝现象。冬季做该实验时由于环境温度过低，最好将反应板置于30°C温箱中。5、96孔V型微量反应板是否洗净，是否光滑也会影