DB21-T 3367-2021海洋生物体腔液中皮质醇的测定

ICS67.050

CCSB50/59

备案号：79042-2021DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3367—2021

海洋生物体中皮质醇的测定

Determinationofhydrocortisoneinmarineorganism

DB21/T3367—2021

海洋生物体中皮质醇的测定

1范围

本文件规定了海洋生物体中皮质醇检测的原理、试剂、仪器和设备、样品前处理、样品测定与结果、

方法灵敏度、准确度和精密度。

本文件适用于鱼类、虾类、棘皮类、贝类生物体中皮质醇的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定

GB/T30891水产品抽样规范

3方法原理

生物样品中的皮质醇，用0.2%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱净化、浓缩，超高效液相色谱质谱

联用仪检测，外标法定量。

4试剂

4.1乙腈：色谱纯。

4.2甲酸：色谱纯。

4.3氯化钠：分析纯。

4.4无水硫酸钠：分析纯。

4.50.1%甲酸溶液：用移液管量取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL。

4.60.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取1mL甲酸，用乙腈（80%）稀释并定容至500mL。

4.7标准品：皮质醇（hydrocortisone，C21H30O5，CAS号50-23-7，纯度98%以上）。

4.8标准贮备溶液（10mg/L）：准确称取1.00mg皮质醇标准品，用乙腈稀释至10mg/L，避光贮存

在-18℃下。

4.9标准溶液(1mg/L)：准确吸取标准贮备溶液1mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，避光冷

藏贮存于2~6℃下。

4.10针孔式微孔滤膜：0.22μm，有机系。（亲水性聚丙烯、玻璃纤维、亲水性PTFE、聚醚砜或其

它等效材质）

4.11除非另有说明，在分析中所使用的水均符合GB/T6682规定的一级用水。

5仪器和设备

1

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5.1超高效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源、三重四级杆。

5.2固相萃取装置：固相萃取柱，CaptivateEMR（200mg，6cc）。

5.3离心机：转速：5000r/min。

5.4分析天平：感量0.0001g和感量0.01g。

5.5高速组织捣碎机。

5.6均质机。

5.7氮吹仪。

5.8涡旋混匀仪。

6测定步骤

6.1样品制备与保存

6.1.1水产品的试样抽取：按GB/T30891的规定执行。

6.1.2水产品试样制备：取样品约100g，用高速组织捣碎机充分捣碎，均质机混匀，均分成2份，

一份用于检测，另一份作为留样。

6.1.3样品于-18℃下冷冻避光存放。

6.2提取

称取样品5.00g，置于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入10mL的0.2%甲酸乙腈溶液，充分摇匀，

涡旋，加入1g的氯化钠和4g的无水硫酸钠，充分涡旋混匀1min，超声10min，静置，以5000r/min

4℃离心15min，取上清液4mL，放入空的聚丙烯塑料离心管中，加入1mL水，混匀，待净化。

6.3净化和浓缩

将待净化溶液全部倒入固相萃取柱，保持约每秒一滴的流速，收集全部流出液(抽干)，45℃水浴浓

缩氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用水定容至1mL，上清液经有机滤膜0.22µm过滤至进样瓶中，供超高

效液相色谱质谱联用仪检测。

6.4样品测定

参照下述条件进行测定：

－BEHC18柱（2.1×50mmi.d.,1.7μm）；

—流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱顺序见表1；

—进样量：10μL；

—柱温：30℃；

—流速：0.2mL/min。

表1梯度洗脱顺序

时间（min）0.1%甲酸水溶液（%）乙腈（%）

初始9010

1.007030

2.005050

3.003070

2

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4.001090

5.009010

6.009010

—电离模式电喷雾电离，正模式。

—扫描模式：多反应监测（MRM）模式，监测离子对（m/z）参见表2。

表2质谱条件

化合物离子模式分子离子对驻留时间锥孔电压碰撞能量

m/zsVeV

363.2>121＊0.1634222

皮质醇ESI+

363.2>3274216

＊代表定量离子

6.5标准曲线的绘制

吸取标准溶液（4.9）5mL，用流动相逐级稀释，配制成浓度分别为0、5.0、10.0、20.0、50.0、

100μg/L的混合标准系列工作溶液，将此混合标准系列工作溶液按色谱、质谱条件测定，通过仪器工

作站制定外标法标准曲线，标准溶液总离子流色谱图参见附录A。

6.6分析

将样品溶液注入液相色谱质谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到样品溶液中皮质醇的质量浓度。

在同样测试条件下，样品溶液中皮质醇的保留时间与标准溶液中皮质醇的保留时间之间的偏差在±

2.5%以内，且样品溶液中皮质醇的定性离子的相对丰度与质量浓度相近的标准溶液中皮质醇的定性离子

的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3的要求，则可判定样品溶液中存在被测化合物。

表3定性离子相对丰度的最大允许偏差

定性离子相对丰度>50%>20%＜50%>10%＜20%≤10%

允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%

7计算

试样中皮质醇的含量，按下列公式（1）计算，结果保留3位有效数字，符合GB/T8170的数字修约

要求。

X=CV1000

m........................................................................(1)

X——试样中皮质醇含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——通过标准曲线计算的皮质醇浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的称取量，单位为克（g）。

8线性范围、灵敏度、精密度

3

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8.1线性范围

皮质醇标准溶液线性范围为0μg/L～100μg/L。

8.2灵敏度

皮质醇的检出限浓度为0.11μg/kg，定量限为0.35μg/kg。

8.3精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的15%。

4

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AA

附录A

（资料性）

皮质醇总离子流色谱图

_________B____________

5

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则编写。

本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。

本文件主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院、大连海关技术中心、大连海洋学校

本文件主要起草人：刘桂英、王琦、葛坤、田金、宋广军、胡超魁、邵泽伟、李安龙

本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，

我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。

归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅农产品质量安全监管局（沈阳市和平区太原北街2号综

合楼A座），联系人：马京京，联系电话13840306249，电子邮箱：lnncpjg@163.com

文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号），联系电话：