划重点！NGS中DNA建库方法全面解析

划重点!NGS中DNA建库方法全面解析高通量测序技术的飞速发展，测序通量大幅增加，要求上游样本是：将提取好的DNA片段化，在进行末端修复和加A尾，然后连接上接头(adapter),最后通过PCR扩增(可选),中间再穿插着纯化/利于未知拷贝数的和基因组变异的检测，是全基因组测序和外显子测序的主要建库手段，目前市面上有很多试剂盒供应，直接应用试剂盒列，末端修复之后，先在3,端连接带P7的接头，再在5,端连接带P5的接头，最后通过PCR扩增(可选)完成文库构建(见图3)。Swift库实验。但此方法操作比较繁琐，新手很难达到其官方宣传的建库效3'LigationofP7P1三转座酶法建库若干抗性基因和编辑转座酶基因的DNA片段，是一种细菌转座子，最早在大肠杆菌中发现。NGS文库构建即把DNA样本片段化或筛分成指定长度的目标序列，再加上寡核苷酸接头P5、P7(和条形码末端修复、接头连接、文库扩增、多次纯化分选等步骤，耗时较长，将Tn5用于测序文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、接头连接DNA、转座酶(Tnp)和Mg²+(激活剂),转座法建库形成的文库结构如下：图3.转座法建库文库结构的Tn5转座复合体(见下图4)。该复合体识别受体DNA的靶序列(Targetsite),切断受体DNA,并插入携带的供体DNA,形成一端DNA,之后通过PCR加上Barcode以及接头其余部分，形成含P5端AccessibleChromatinwithhighthroughpAmplificationviaTransposonInsertion,通过转座子的线性放大),单倍体分型，结构变异检测等，不仅高效简便，有效缩短NGS样本建库时间，实现规模化快速测序，提高测序分辨率，同时能够被灵活改扩增子建库是指利用PCR反应在待测DNA片段两端加上接头的方法，原理相对比较简单，只需要两轮PCR和两步纯化就可以得到目标区域的文库(如图5),其中第一步是含通用序列的引物与目标区域结合，第二步通过PCR反应连接测序接头，使得构建的文库可以用于上机测序(图6)。电泳检测电泳检测钟国电完图5.扩增子建库的操作步骤构建。在临床背景下，扩增子建库方法可以针对疾病目标基因进行捕获，提高目标基因检测的覆盖度和测序深度，解释临床结果。相对于其他建库方法来说，扩增子方法建库可以通过单次测序反应检测更多患者样本，后期生信分析的任务大大减少，得到的数据更易于储存和出的引物不能完全扩增出所有的待测片段会导致最终的文库覆盖率较2)当扩增子之间有重叠时，为了避免重叠部分产生的短扩增子的优势扩增的影响，需要有两个或多个引物池，这样就会导致试验流程3)多重PCR反应中容易出现引物二聚体的积累，引物二聚体由了引物二聚体的形成机会，而引物二聚体的扩增会大量消耗引物本身文库PCR富集，纯化PCR产物(见图7)。图7.平末端接头连接建库方法流程图(IonTorrent平台)总结综上，NGS建库可以按照接头加入目的片段的不同分为5种，其中TA克隆连接接头建库法应用最广泛，适用于绝大多数样本建库，是目前商业化建库方式的主流；Swift法与TA克隆连接接头法类似，操作上相对繁琐，P5接头和P7接头是分两步连接上的；转座酶法只需1h40min即可完成文库构建，可以节省大量的人力，但是在应用上只适用于cDNA和全基因组等文库的构建，且转座酶本身具有偏好性，种，适用于临床背景下靶向基因的研究，平末端连接接头建库适用于应用范围相对较少(见下表)。表NGS5种建库方法比较适用平台应用特点TA克隆连按按头建库全基因组测序等尤其适用于cfDNA等微量起始量样本转座酶法建库全基因组/全外显子测序快速，但是有一定偏好性PCR扩增子建库靶向测序成本较低，适用于临床样本数据靶向检测.能捕获到的信自有限.赶时长HeffNGS8LibraryNGS建库理库模块HieffNGSFastPaceDNAFragmentationReagent(Cat*12609)HieffNGS8FastPaxeEndRepair/dA-TalingModule(Cat#12602xSuperCanace③IIHigh-FldelityMbforLibraryAmplfication(Cat#12621)HleftNGS③Dual-Mode相关产品Tn5接头HioffNGS③384d