骨骼肌兴奋与收缩实验3

实验1骨骼肌兴奋与收缩实验梅汝焕E-mail:rhmei@医学院机能中心实验成绩评定方法本次实验总分：10分预习、课堂讨论、回答问题 2分实验态度、实验操作、实验完成质量 4分实验报告 4分格式、方法、结果表述 2分讨论 2分实验成绩评定方法学生旷课，记0分学生请假，须补做实验，没有补做实验，报告不计分课堂上不动手操作，实验操作部分扣4分；因操作者原因，导致实验完全失败，实验操作部分扣4分报告迟交，7日内，实验报告部分扣2分，超过7天，实验报告部分扣3分。学生不交实验报告，扣4分实验报告要求按照《浙江大学学报-医学版》投稿要求撰写实验报告结果要用图或表说明讨论要深入要用一定数量的参考文献（非教材）单位：浙江大学医学院2011级临床医学专业2B班采用word2003撰写，文件后缀为.doc文件名：实验序号-实验班级-姓名.doc（如：实验1-2B班-张三.doc）交给组长，汇总后交给班长，班长交给任课教师:rhmei@课堂安排讲解：实验方法和观察项目，其中穿插检查评讲演示：标本制备、肌肉收缩曲线引导、数据测量同学自己实验数据汇总统计讨论：对实验数据统计结果的分析与机制探讨目的（Objective）学习蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备方法、微机生物信号采集处理系统的使用方法。探究刺激蟾蜍坐骨神经对腓肠肌收缩的影响，分析刺激强度、刺激频率与骨骼肌收缩张力的关系。探究神经、骨骼肌兴奋的电变化与肌收缩的关系。这两只蟾蜍哪一只是雄？有哪些特征可以鉴别出蟾蜍的雌雄？1.材料和方法(Materialsandmethods)1.1实验动物（laboratoryanimal)蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种，ZhuoshanToad）♂蟾蜍皮肤光滑，前肢趾上有黑色、粗糙的斑块（婚垫）,会鸣叫；♀蟾蜍皮肤粗糙，无婚垫，不会鸣叫。蟾蜍属两栖动物，其一些基本生命活动与哺乳动物近似，其离体组织和器官所需的生理环境比较简单(无须供氧和恒温)。蟾蜍常用于神经生理、肌肉生理、心脏生理，微循环、水肿等实验。1.2药品任氏液(Ringer`ssolution)和20%高渗甘油任氏液英国生理学家林格(SydneyRinger，1835～1910)发明由无机盐和蒸馏水配置而成，每升溶液含NaCl6.5g、KCl0.14g、CaCl20.12g,、NaHCO30.20g、NaH2PO40.01g用于两栖类动物组织器官润湿和营养。任氏液是模仿蟾蜍的什么成分配制？1.3器材(experimentalinstallation)RM6240生物信号处理系统(RM6240biolgicalsignalcollectingsystem)（成都仪器厂）、神经肌肉标本盒（nerve-musclechamber)。RM6240C生物信号处理系统RM6240生物信号处理系统可以同时采集、放大、显示、记录、分析四路生物信号及一路刺激输出，12导联心电图输入记录，可用于人体和动物实验。仪器参数全程控设置，有多种数据分析功能和数据转换输出功能。

神经肌肉标本盒。探针(metalprobe)锌铜弓(bimetalelectrode)玻璃分针(glassdissectingtool)张力换能器锌铜弓有何作用？实验解决问题的常用方法提出问题（做什么？）对问题提出假设验证问题（怎么做？）设计实验执行实验统计结果分析结果得出结论（做什么？）（怎么做？）实验研究一般要经历哪些过程？4.甘油对骨骼肌收缩张力有何影响1.不同刺激强度对骨骼肌收缩张力的影响

不同刺激强度与肌肉收缩的关系？阈强度（阈刺激）和最大刺激？提出问题（做什么？）2.不同刺激频率对骨骼肌收缩张力的影响不同刺激频率刺激与骨骼肌收缩的关系？甘油浸泡后，骨骼肌收缩张力？作用部位？3.不应期对骨骼肌收缩张力的影响不应期与骨骼肌收缩张力的关系？骨骼肌收缩张力是否随刺激强度增加而相应增大？多大强度刺激可以产生阈强度（阈刺激）和最大刺激？4.甘油对骨骼肌收缩张力有何影响1.不同刺激强度对骨骼肌收缩张力的影响

对问题提出假设2.不同刺激频率对骨骼肌收缩张力的影响最大刺激时，骨骼肌收缩张力是否随刺激频率增加而相应增大？最大刺激时，随刺激频率的增加肌肉的收缩形式是否会发生改变？甘油能否降低骨骼肌收缩张力？甘油降低骨骼肌收缩的作用位是在：点神经干动作电位、突触传递、骨骼肌动作电位、兴奋-收缩偶联、收缩过程？3.不应期对骨骼肌收缩张力的影响不应期能否降低骨骼肌收缩张力？1.不同刺激强度对骨骼肌收缩张力的影响

验证问题（怎么做？）实验设计：实验装置模型坐骨神经干腓肠肌装置模型实验分组（干预措施）对照组—自身前后对照不同刺激强度处理组观察项目骨骼肌收缩张力2.不同刺激频率对骨骼肌收缩张力的影响

实验设计：实验装置模型坐骨神经干腓肠肌装置模型实验分组（干预措施）对照组—自身前后对照不同刺激频率处理组观察项目骨骼肌收缩张力、收缩形式3.不应期和甘油对骨骼肌收缩张力有何影响实验设计：实验装置模型坐骨神经干腓肠肌模型实验分组（干预措施）对照组甘油处理组不同波间隔的双刺激观察项目神经干动作电位（幅度、时程）骨骼肌肌膜动作电位（幅度、时程）骨骼肌收缩张力（收缩幅度、收缩时程、舒张幅度、舒张时程）分析结果使用甘油前后神经干动作电位有无变化？骨骼肌肌膜动作电位有无变化？骨骼肌收缩张力有无变化？对照假设，以上结果说明什么问题？设计及操作有无需改进之处？可否设计更进一步的研究进行验证？无变化无变化消失1.4实验装置模型的建立坐骨神经干-腓肠肌收缩模型实验动物：蟾蜍刺激坐骨神经干引起腓肠肌收缩刺激：电刺激，可控记录：信号采集系统，可分析刺激输出记录1.4.1仪器连接和参数(apparatusjunctionandparameter)检查实验装置连接：神经肌肉标本盒1对引导电极接微机生物信号处理系统3通道，换能器接第1通道。调节一维微调，使换能器处于适当高度并在微调可调节的最低位置。一维微调调节螺丝RM6240C微机生物信号处理系统换能器的固定调节装置1.4.2在体坐骨神经腓肠肌标本制备

蟾蜍毁脑脊髓坐骨神经干-腓肠肌标本的在体分离术坐骨神经干-腓肠肌标本制备1.4.3坐骨神经腓肠肌标本的放置和连接坐骨神经腓肠肌的股骨插入固定孔固定，神经干放置在标本盒的电极上，神经与电极接触良好。神经干坐骨神经腓肠肌标本的放置和连接实验项目（执行实验）检查评讲探究问题一2.观察（Observations)2.1刺激强度对肌肉收缩张力的影响跟腱结扎线垂直固定在换能器的悬臂梁上用一维微调旋钮调节跟腱结扎线的紧张度，即调节前负荷为2.5+0.5g使用一个中等刺激（1v），检查确定标本、仪器是否工作正常请判断图中记录曲线的阈刺激（阈强度）、最大刺激在哪里？试述阈刺激（阈强度）、最大刺激的含义。阈刺激最大刺激手工记录阈刺激、最大刺激的刺激强度保存数据文件点【停止记录】菜单按钮→文件→另存为…注意：数据不能存在“C盘”。2.2最大刺激时，不同刺激频率刺激坐骨神经对骨骼肌收缩张力的影响请指出图中单收缩和不完全强直收缩的交界点，并说明产生不完全强直收缩的原因。2Hz18Hztwitchincomplete

tetanuscomplete

tetanus保存数据文件点【停止记录】菜单→文件→另存为…注意：数据不能存在“C盘”。2.3观察甘油对骨骼肌收缩的影响2.3.1观察不应期对肌肉收缩的影响abc张力换能器腓肠肌固定螺钉引导电极股骨坐骨神经坐骨神经-腓肠肌标本打开配置：“实验”——“骨骼肌兴奋与收缩”刺激模式：“双刺激”，最大刺激强度记录波间隔为0.1,0.5,1,10,100,1000ms时的神经干动作电位骨骼肌动作电位骨骼肌收缩张力同步触发前一定要打√2.3.2甘油对骨骼肌收缩的影响配置文件：同“不应期对肌肉收缩的影响”模型装置：在“不应期对肌肉收缩的影响”基础上，用棉花包裹腓肠肌，于肌腱处滴加20%甘油高渗任氏液1-2滴，同时注意湿润神经干采用最大刺激（同步触发），记录神经干动作电位骨骼肌动作电位骨骼肌收缩张力每隔3分钟刺激一次，直至骨骼肌收缩消失记录出现有AP无肌肉收缩的时间注意保存实验数据2.4实验数据的测量分析2.4.1不同刺激强度和频率对骨骼肌收缩张力的影响2.4.2不应期和甘油对骨骼肌收缩张力的影响神经干动作电位幅度时程骨骼肌肌膜动作电位幅度时程骨骼肌收缩张力幅度收缩时程时程幅度收缩时程幅度2.4.3测量最大刺激时，肌肉收缩的潜伏期、收缩期时间和舒张期时间latentperiodcontractionphasesrelaxationphases2.4.3测量实验数据汇总电脑桌面↓lab2-00↓打开实验数据表↓在相应组别中填入实验数据↓保存3.1不同刺激强度刺激坐骨神经对腓肠肌收缩张力的影响刺激波宽0.1ms的单刺激，阈刺激强度为

Uth±sV，最大刺激强度为

Umax±sV，阈强度刺激时的肌肉收缩力

x1±s(g)]显著低于最大刺激强度刺激时的肌肉收缩力

x2±s(g)，两者有显性差异（p<0.05)，见表1

样本阈强度最大刺激强度强度（V）收缩张力（g）强度（V）收缩张力（g）123456x±s表1.不同强度刺激对蟾蜍腓肠肌收缩张力的影响注：*p﹤0.05、**p﹤0.01vs阈刺激组3.结果（results)

T（g)U(V)MaximalstimulusThreshold

stimulus3.2刺激强度（U）与肌肉收缩张力（T）的关系在阈刺激强度与最大刺激强度之间，腓肠肌的收缩力随着刺激强度的增大而增大，刺激强度大于最大刺激强度，腓肠肌的收缩力不再增大，见图1、图2。Fig.1forcevsstimulusvoltagebehavior张力（g）阈刺激最大刺激5g0图.1刺激强度与肌肉收缩张力的关系曲线刺激强度（V）0.50.70.93.3不同频率刺激刺激坐骨神经对腓肠肌收缩张力的影响刺激波宽0.1ms，最大刺激强度时，单收缩的刺激频率为

Ft±sHz，不完全强直收缩的刺激频率为

Ficts±sHz

至

Ficte±sHz

、完全强直收缩的刺激频率为

Fcts±sHz

至

Fcte±sHz

。不完全强直最大收缩力

Tict±s(g)和完全强直最大收缩力

Tct±s(g)显著高于单收缩的最大收缩力为

Tt±s(g)（p<0.05），见表2

样本单收缩不完全强直收缩完全强直收缩频率（Hz）张力（g）频率（Hz）张力（g）频率（Hz）张力（g）12345678910x±s注：*p﹤0.05、**p﹤0.01vs单收缩组表2.频率刺激对腓肠肌收缩张力的影响

T（g)F(Hz)completetetanusincomplete

tetanusFig.2forcevsstimulusfrequencybehavior

3.4收缩张力与刺激频率的关系最大刺激时，随着频率刺激的逐渐增大，腓肠肌的收缩力不断增加，到完全强直收缩后，再增加刺激频率，腓肠肌的收缩力增大趋缓，见图23.5不应期、甘油对骨骼肌收缩的影响根据实验数据，参照“不同强度和频率对肌肉收缩的影响”自己组织文字描述实验结果，制作图表。组别肌肉的收缩张力0.1ms0.5ms1ms10ms100ms1000ms12345678910x±s表3不同刺激波间隔的肌肉收缩张力（单位：克）实验注意事项破坏脑脊髓不要挤压蟾蜍头部两侧大的耳后腺，避免蟾酥溅入眼内。操作过程中避免过度牵拉神经和肌肉，避免用手和铁器触碰神经和肌肉，经常给神经和肌肉滴加任氏液，以免干燥。实验过程中保持换能器与标本连线的张力不变。因为影响腓肠肌收缩力的主要因素有前负荷、后负荷、腓肠肌本身的收缩能力。分离坐骨神经肌肉标本前洗手洗器械数据保存：按下“停止”按钮，选中菜单栏“文件”主菜单栏下的“另存为”，将当前数据另外取文件名存至硬盘安全卫生各小组卫生剪刀、探针、玻璃皿用水冲洗所有器械擦拭干净，无水迹实验台面整洁、干净值日组卫生:督查各组善后工作；扫地、拖地，凳子放整齐；清洁洗涤台动物尸体讨论：阈刺激与最大刺激1.腓肠肌大多数是快颤搐型肌纤维[1]

，支配腓肠肌收缩的神经是A

纤维，A

纤维的直径有很大差异，其阈值也有较大差异[1，2]。单干恒定时间的方波电压刺激坐骨神经干，电压低于阈值的强度刺激，坐骨神经干支配腓肠肌的神经纤维不发生兴奋，其所支配的肌细胞也不会发生兴奋和收缩。刺激电压达到阈强度时，坐骨神经干中阈值最低的神经开始兴奋，其所支配的运动单位的肌纤维兴奋并发生收缩，刺激强度逐渐增大，坐骨神经干中兴奋的神经纤维增加，兴奋和收缩的运动单位增加，其所募集的收缩张力也增加。刺激电压达到使支配腓肠肌的A

纤维全部兴奋，腓肠肌全部的运动单位增加都兴奋并收缩，收缩张力达单收缩最大值。阈刺激

在单个刺激，刺激持续时间、强度-时间变