微生物降解香菇栽培料中的棉酚

姓名：包刘媛学号：20111052112微生物降解香菇栽培袋料中的棉酚研究可行性分析课题背景、意义、思路材料与方法参考文献目录一、课题背景、意义、思路1、背景：①香菇营养丰富，味道鲜美，并具有药用价值。分布广，尤其是云南地区。大量种植香菇给千家万户带来了丰厚的回报。香菇的栽培方式主要有段木栽培、袋料栽培两种，而袋料栽培是最为通用的。但是香菇在收获之后剩下了大量的栽培袋料，虽然香菇栽培袋料中含有大量的蛋白质，粗脂肪，纤维素等营养成分，是一种非常好的资源，但是由于使用棉籽壳作为其主要原料，它含有一定量的有毒物质-棉酚，会对动物生产、发育和繁殖等产生不良的影响，因此不能将其再使用，成为一种废弃物和污染源，造成巨大的浪费。②国家在饲料卫生标准中规定肉用仔鸡，生长鸡配合饲料中的游离棉酚的允许量不得大于100mg／kg，肉用仔猪，生长肥育猪配合饲料中的游离棉酚的允许量不得大于60mg/kg．欧盟对单胃动物日粮中游离棉酚允许量的规定与中国标准一样，除此之外还规定了反刍动物日粮中游离棉酚允许量，其成年牛，山羊，绵羊≤500mg／kg，犊牛≤100mg／kg，其他不含棉籽饼粕饲料和配合饲料≤20mg／kg．因此如果将香菇栽培袋料作为饲料再利用，必须除去栽培袋料中的棉酚，既可作为饲料在利用。③传统棉酚脱毒主要可分为物理脱毒法，化学处理法等．然而物理脱毒法脱毒率低，化学法会造成溶剂残留等缺点，因此近几年新兴的棉酚脱毒方法主要是微生物发酵法脱毒．2、意义：本课题尝试从饲料允许添加的微生物菌种中，筛选出最优的菌种和发酵方式，通过发酵过程条件优化，获得符合国家标准的新饲料源，并提高其营养价值和利用率．3、思路：①、由于棉籽饼发酵脱毒常用的菌株为黑曲霉，乳酸菌，酿酒酵母，而本研究主要目的是对香菇栽培袋料中的棉籽壳进行脱毒，所以选用以上三种菌种进行单菌发酵及复合发酵处理。②、由于温度、含水量、接种量因素的影响，所以要设置不同的条件进行试验。③、若由上两点组合控制变量试验，工作量太大，可以先设定一个常规条件用上述三种菌种进行单菌发酵及复合发酵处理，看其脱毒效果。若效果明显再进行控制变量单因子优化试验。二、材料与方法1、材料①样品：香菇栽培料（由楚雄种植香菇处提供，样品均粉碎后备用。）②设备：培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超声波仪，离心机，真空抽滤仪，研磨机，冰箱等．③仪器：陶瓷盘，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，试管等。⑤试剂：棉酚标准品(含99％纯棉酚)，浓盐酸，丙酮，间苯三酚，95％乙醇等。⑥菌种：干酪乳杆菌(LacticacidbacteriaT7)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)C（对照组）R:干酪乳杆菌组J:酿酒酵母组H:黑曲霉组R+J（1:1）R+H（1:1）H+J（1:1）H+J+R（1:1:1)条件：温度37℃，接种量10%，含水量50%，20g/组香菇栽培袋料①微生物固体发酵：将栽培袋料和菌种搅拌均匀后，盖上6层润湿纱布防止灰尘，放人恒温培养箱中37℃发酵48h，结束后60℃烘干，48h后存放于干燥器中待测。2、方法②、游离棉酚测定方法：A、棉酚标准溶液的制备．准确称取0.005g棉酚标准品，用70％丙酮溶液溶解，并用50mL容量瓶定容，溶液棉酚浓度100μg/mL．B、显色剂的配置：用100mL量筒量取16.6mL浓盐酸(12.0mol/L)，加入95％的乙醇至100mL刻度，倒入100mL三角瓶中，摇匀，再加入1g间苯三酚，溶解后混合置于三角瓶中放入冰箱中备用(显色剂颜色变黄时不能使用，现配现用)．

C、标准曲线的绘制．准确吸取100μg/mL棉酚标准溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL加入10mL试管内，编号1-6号,再依次加入70％丙酮溶液1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0mL，各试管中再加入2mL显色剂，摇匀，在55℃恒温水浴箱中加热5min．用70％丙酮溶液调零，在550nm波长处测定吸光值并绘制标准曲线，得其回归方程。

D、样品棉酚含量的测定．准确称取样品1.0g于具塞锥形瓶中，首先加入约15mL丙酮溶液，盖上瓶塞，超声15min，9000rpm条件下离心，将上清液回收于100毫升试管中静置，重复以上步骤两次，用中速滤纸将回收的上清液过滤于50mL容量瓶中，丙酮溶液洗涤并定容．移取滤液1mL于试管中，各加入2mL显色剂，摇匀，测定550nm处吸光值，计算滤液棉酚含量．

E、样品棉酚含量计算．计算公式：Y=（X*Z）/(n*m)式中，y为样品中游离棉酚的含量(mg/kg)；X为测定用样液中游离棉酚的含量(μg/mL)；Z为样品提取液体积(mL)；力为称取的样品质量(g)；m为吸取滤液体积(mL)．脱毒率的计算：脱毒率(％)=1一样品棉酚含量/对照棉酚含量

③单因子优化：

称量20g粉碎过筛的香菇栽培袋料至陶瓷盘中，选取合适的发酵菌种，进行含水量，温度，接种量三个因素的单因素优化试验．接种量：按照5％，10％，15％，20％，25％的接种量接人处理过的香菇栽培袋料中，含水量50％，37℃发酵48h，发酵结束后烘干48h测定棉酚含量．

含水量：按照50％，55％，60％，65％，70％的含水量，固定接种量和温度发酵48h，发酵结束后烘干48h测定棉酚含量．温度：按照30℃，35℃，40℃，45℃，50℃的培养温度，固定接种量和含水量发酵48h，发酵结束后烘干48h测定棉酚含量．

同时每一组设置三个重复减小误差④数据分析：用SPSS17.0软件对实验数据进行方差分析。三、可行性分析1、取材：取材方便。

①、香菇栽培料，由楚雄种植香菇处提供，11、12月份真是采收时期，有大量的废弃栽培料；②、试剂：酚标准品(含99％纯棉酚)，耗材不多，可支付范围内；浓盐酸，丙酮间苯三酚，95％乙醇，实验室都有。③、菌种：干酪乳杆菌(LacticacidbacteriaT7)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，黑曲霉(Aspergillusniger)实验室也有；2、设备：

培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超声波仪，离心机，真空抽滤仪，研磨机冰箱等微生物实验室都有。3、仪器：陶瓷盘，量筒，滴管，容量瓶，三角瓶，试管等都是实验室常用仪器。4、操作：

简单方便，都是常规操作；5、耗时：

一组实验大约要50h，其中发酵培养要48h，干燥48h.而标准曲线的制定需要6h，初步可行的话，加上后面的优化实验50h，后期数据分析大概一星期，准备工作一星期，若遇问题处理时间三星期SO~~~保守估计：一之三个月。当然这只是估计时间。四、参考文献[1]春芳，李全丰，王彩玲．生料固态发酵法降鳃棉酚的工艺研究[J]．中国饲料，2011，3：41．[2]王利，汪开毓．动物棉酚中毒的研究进展[J]．饲料与添加剂，2002.5：26-28．[3]阎轶洁，宋维平，等．棉籽饼粕在畜禽中的应用及棉酚的脱毒方法研究[J]饲料工业，2005,26(3)：47—50．[4]石秀侠，程茂基，蔡克周，等．棉籽饼有毒物质及其脱毒方法研究进展[J]．饲料博览，2005,(6)：8—10．[5]王红云，高占峰，付才．棉籽饼粕脱毒方法研究进展[J]．河北农业科学,2004,8(1)：67—68．[6]乔国平，王立，王兴国．棉籽饼粕脱毒方法研究进展[J]．粮食与油脂，2002,(3)：27—29．[7]朱德伟，刘志鹏，蔡国林．高效降解棉酚菌种的筛选及棉粕发酵脱毒工艺研[J]．中国油脂，2010，35(2)：24．[8]文举．高效降解棉酚菌种的选育及棉粕生物发酵的研究[D]．杭州：浙江大学,2006．[9]顾赛红，孙建义，李卫芬．黑曲霉PES固体发酵对棉籽粕营养价值的影响[J]．中国粮油学报，2003，18(1)：70．[10]杨继良，周大云，杨伟华，等．高效降解棉酚菌种的筛选及棉籽饼脱毒参数的研究[J]．棉花学报，2000，12(5)：225．[11]张文举，许梓荣，孙建义，等．假丝酵母zD3与黑曲霉Zn8复合固体发酵对棉籽饼脱毒及营养价值的影响研究[J]．中国粮油学报，2006，21(6)：129．[12]赵顺红．棉粕生物发酵脱毒效果[D]．新疆石河子：石河子大学。2007：31．[13]全鑫，周春雨，范婕妤．草甘麟高效降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[J]．四川大学学报：自然科学版，20lO，47(4)：921．[14]吴嫒瑾，王承明，吴谋成．响应面优化棉籽饼粕中棉酚的提取条件[J]．棉花学报，2009，21(2)：94．[15]李真金，任丹，苏文涛．L-乳酸高产菌选育及其发酵条件的优化[J]．四川大学学报：自然科学版，2011，48(2)：451．[16]李涛，岳田利，袁亚宏．苹果多酚提取的响应曲面