王鸿利遗传性凝血因子和抗凝因子缺陷

上海交通大学附属瑞金医院上海血液学研究所王鸿利王学锋等遗传性凝血因子和抗凝因子缺陷症的诊断与血友病A的基因治疗研究背景研究背景遗传性凝血因子缺陷症和抗凝因子缺陷症分别导致遗传性出血病和血栓病患者往往自幼发病，持续终生，致残率高、危害性大、甚至导致死亡，并遗传至后代替代治疗仍是目前唯一有效的治疗手段，基因治疗是根治本病的最佳选择研究内容

研究内容研究对象qp项目血友病A血友病B合计携带者诊断741791产前诊断40646研究对象研究方法家系资料实验表型基因诊断临床资料体外表达研究临床诊断临床治疗研究流程出血病以血友病A为例出血为特征大关节肌肉腰大肌内脏皮肤粘膜皮肤淤斑颅内出血研究方法-临床诊断研究方法-临床诊断血栓病以抗凝血酶缺陷症为例浅静脉炎深静脉血栓内脏静脉血栓肺栓塞研究方法-家系调查（FVIII)研究方法-家系调查（FVII)研究方法-家系调查（AT缺陷症)研究方法-筛选试验和表型诊断实验1.凝血因子缺陷症筛选试验：①APTT↑，PT正常：因子VIII缺陷症（血友病A）、因子IX缺陷症（血友病B）、因子XI缺陷症因子XII缺陷症②APTT正常，PT↑：因子VII缺陷症③APTT↑，PT↑：因子X缺陷症、因子V缺陷症、凝血酶原缺陷症、纤维蛋白原（Fg）缺陷症④APTT正常，PT正常：因子XIII缺陷症研究方法-筛选试验和表型诊断实验2.vWD筛选试验：①BT②APTT③FVIII:C3.抗凝因子缺陷筛选试验：①APCR②proGlobal试验研究方法-筛选试验和表型诊断实验4.凝血因子缺陷症表型诊断试验：Fg(clauss法)FII:AgFII:CFV:AgFV:CFVII:AgFVII:CFVIII:AgFVIII:CFIX:AgFIX:CFX:AgFX:CFXI:AgFXI:CFXII:AgFXII:CFXIII:AgFXIII:CvWFR:cofvWF:Ag多聚体分析研究方法-筛选试验和表型诊断实验AT:AAT:AgPC:APC:AgTPS:AFPS:At-PA:At-PA:AgPAI:APAI:AgPLG:APLG:Agα2-AP:Aα2-AP:AgTAFI:ATAFI:Ag5.抗凝因子缺陷症的表型诊断试验：研究方法-分子（基因）诊断DNA/RNA抽提RFLPPCR扩增（RT-PCR、ASPCR）直接核酸测序DGGE检测流程研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断3.因子VIII缺陷症（血友病A）：基因位点检测：BclI、CA13、CA22的STR以及DXS52（ST14）阳性率49%直接测序阳性率100％研究方法-分子（基因）诊断4.因子IX缺陷症（血友病B）：用长距离PCR（LD-PCR）测定DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094和DXS1227等6个位点的STR作基因分析，阳性率达100%研究方法-分子（基因）诊断5.其他凝血因子缺陷症：无（异常）纤维蛋白原血症、凝血酶原缺陷症、因子V、VII、X、XI、XII、XIII缺陷症采用PCR扩增所有外显子及其侧翼序列，基因测序的方法进行基因诊断采用限制性酶切分析（RFLP)或等位基因特异性PCR（ASPCR）对发现的基因突变进行验证研究方法-分子（基因）诊断6.抗凝因子缺陷症：AT缺陷症、PC缺陷症、PS缺陷症采用PCR扩增所有外显子及其侧翼序列，基因测序的方法进行基因诊断采用限制性酶切分析或ASPCR对发现的基因突变进行验证转染真核细胞生物代谢标记活性与抗原检测免疫荧光染色Western印迹构建突变基因cDNA的表达载体研究方法-体外表达研究研究流程HewittJ,etal.SevereFVIIdeficiencycausedbyanewpointmutationcombinedwithapreviouslyundetectedgenedeletion.BrJHaematol.2005;128(3):380-5.研究方法-体外表达研究其他研究:根据突变位点的特殊性，设计特异性的功能研究试验例如针对在信号肽或糖基化位点发生的突变等，可采用体外无细胞蛋白翻译试验，研究突变导致缺陷症的详细分子发病机制PCR扩增外周血DNA抽提（携带者）羊水DNA抽提（胎儿）直接核酸测析间接联锁分析明确诊断内含子1,22倒位研究方法-血友病携带者和产前诊断LaveryS.Preimplantationgeneticdiagnosis:newreproductiveoptionsforcarriersofhaemophilia.Haemophilia.2004;10:126-32研究流程传统方法：采集羊水单细胞植入前诊断研究方法-携带者和产前诊断研究方法-血友病携带者和产前诊断传统方法血友病AFⅧ内含子22倒位（INV22）、DXS52、BclⅠ、内含子13（CA13）和内含子22（CA22）等5个基因位点进行检测血友病B应用DXS102、DXS1211、DXS1192、DXS8031、DXS8094和DXS1227等6个位点的STR作基因分析

体外受精胚胎发育6-8细胞1~2个单卵裂球细胞FVIII/IX基因分析正常胚胎植入宫内活检取单个细胞单细胞PCR技术植入前遗传学诊断

（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）研究方法研究结果与讨论凝血因子性质抗凝因子性质凝血/抗凝因子机制遗传性凝血因子缺陷症种类基因突变种类参考文献国内国外无（异常）纤维蛋白原血症331凝血酶原缺陷症322凝血因子V缺陷症4243，4凝血因子VII缺陷症11275，6凝血因子VIII缺陷症48227，8凝血因子IX缺陷症148969，10凝血因子X缺陷症3911凝血因子XI缺陷症3512凝血因子XII缺陷症1613凝血因子XIII缺陷症4914血管性血友病416115，16国内外研究现状国内外研究现状抗凝因子缺陷症基因突变种类参考文献种类国内国外抗凝血酶缺陷症12717蛋白C缺陷症233518，19蛋白S缺陷症114820国内外研究现状(PGD)国际报道45种相关基因突变遗传性凝血因子缺陷症数量突变位点低（无）纤维蛋白原血症5FgFGA基因4bpdel(g1892~1899)和1238bpdel（g1978~3215）,FGBArg17Stop,Gly347Arg,FGGArg275His凝血因子Ⅶ缺陷症11Arg304Trp、Arg304Gln、Trp359Met、Arg353Gln,His348Gln、Arg152Gln、IVS1+5G>A、启动子-55G→T、-323insertion(-323po/p10)、G73A凝血因子VIII缺陷8Arg531Cys,Arg538Stop,Ala704Thr,Tyr1680Cys,Arg1966Stop,Arg2116Stop,Arg2150His,Arg2209Stop凝血因子Ⅸ缺陷症5启动子区A13G,G6463A,G17747CG20414A,G308648A凝血因子Ⅹ缺陷症1Thr318Met凝血因子Ⅺ缺陷症1Glu323Lys凝血因子ⅪI缺陷症11627位的C/T

血管性血友病2R1374S，S1506L

蛋白C缺陷症抗凝血酶缺陷症31Arg15Trp,Phe139Val,K150或151delVal404Thr国内首次报道38种相关基因突变类别基因突变位点分子发病机制参考文献凝血因子VII缺陷症Phe40Cys,IVS1a+g>a滞留、降解（Phe40Cys），无凝血活性（IVS1a+g>a）42凝血因子VIII缺陷症His99Arg分泌正常，功能障碍凝血因子X缺陷症Ser-30Arg分泌障碍凝血因子XI缺陷症Leu172ProGly400Val形成二聚体的滞留凝血因子XIII缺陷症Ser413Trp，Arg77Cys分泌障碍，降解加速43蛋白C缺陷症Cys64Trp,Phe139Val分泌障碍，降解加速抗凝血酶缺陷症13889delG.C2603T、C2759T滞留，降解加速（13889delG）；功能障碍（