DB21-T 2981-2018日本落叶松SRAP分析技术规程

ICS65.020.01

B60

备案号：60599-2019DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2981—2018

日本落叶松SRAP分析技术规程

TechnicalRegulationsforSRAPanalysisinLarixkaempferi

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由辽宁省林业厅提出并归口。

本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。

本标准主要起草人：王骞春、冯健、于世河、卜鹏图、陆爱君、汪成成、张素清、陈罡、杨鹤、高英

旭、颜廷武、崔雪、丁彪、潘福民、郑颖、王嘉、高宇、陈波、李程、赵济川。

本标准的附录A，附录B，附录C和附录D为规范性附录。

III

DB21/T2981—2018

日本落叶松种子园遗传多样性的SRAP分析技术规程

1范围

本标准规定了以日本落叶松SRAP分析的定义、术语、分析原理、仪器设备和实验引物、反应程序。

本标准适用于日本落叶松的SRAP分析。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T13016-2009标准体系表编制原则和要求

DB21/T2589-2016东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法

3定义与术语

下列定义与术语适用于本标准。

3.1相关序列多态性sequence-relatedamplifiedpolymorphism;SRAP

利用1对引物设计对开放阅读框（openreadingframes，ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种

的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。

3.2引物primer

一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸

的出发点而起作用的多核苷酸链。

3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction;PCR

在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异扩增待定DNA序列的方法。

3.4引物扩增多态性primeramplifiedpolymorphism

1对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA片段。

4仪器和设备

4.1PCR扩增仪。

DB21/T2981—2018

4.2琼脂糖凝胶电泳系统。

4.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。

4.4凝胶成像系统和照相系统。

4.5超纯水系统。

4.6低温高速冷冻离心机。

4.7超微量紫外/可见分光光度计。

4.8高压灭菌锅。

4.9液氮罐。

4.10超低温冰箱。

4.11高压电泳仪及配套电泳槽。

4.12移液器。

5引物

引物相关信息见附录A。

6试剂与溶液

6.1主要常规试剂见附录B。

6.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录C。

6.3银染试剂见附录D。

7实验程序

7.1实验材料

选用日本落叶松新鲜针叶提取基因组DNA，选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-70℃）

中保存备用。

7.2DNA的提取

7.2.1取0.5g洗干净的针叶，用灭菌剪刀剪成小段置1.5mL离心管中(约至0.1刻度线)。加适量

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和VC（抗坏血酸），再向离心管中加入液氮后用塑料研磨杵将针叶研磨成粉

末。

DB21/T2981—2018

7.2.2加入1ml0℃预冷的CTAB-free提取液，混匀，0℃冰浴10min，期间轻柔颠倒2次-3次，在

4℃下10000r/min离心10min，弃上清。若上清液黏稠，用CTAB-free提取液清洗1次。

7.2.3加入650μL65℃预热的4×CTAB提取液，用无菌枪头小心将其混匀，65℃水浴30min。

7.2.4加入等体积的氯仿:异戊醇(V:V)=24:1的抽提掖，轻柔颠倒离心管10min，使其混匀，10000r/min

离心10min。然后用去尖的移液器吸头小心吸取450μL上清液至另一离心管中，重复此步骤1次-2

次，至白色中间层消失为止。

7.2.5加入2倍体积的冰冷无水乙醇，颠倒混匀，出现絮状沉淀，-20℃放置2h。10000r/min离心10

min，弃上清液。

7.2.670%乙醇清洗2遍，风干后加入100μL灭菌TE缓冲液溶解沉淀。

7.3DNA浓度的检测和定量

用TE缓冲液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量标准，

各取3μLλ-DNA分子量标准溶液和3μL7.1中提取的未知浓度DNA溶液，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，稳

压90V，电泳缓冲液为1×TBE，325nm紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知

DNA的浓度。

将8.2中提取的DNA溶液取10μL后，在1.5mL离心管中用TE稀释200倍，放入石英比色杯中，用紫

外分光光度计检测，记下其在260nm和280nm的光密度值（OD值），按公式（1）计算出DNA的浓度及

OD260和OD280的比值。OD260/OD280在1.8～2.0之间。

D=OD260×n×50/1000

式中：

D—DNA的浓度，单位为纳克每微升（μg/μL）；

OD260—260nm下的光密度值；

n—稀释倍数。

7.4PCR反应

7.4.1PCR反应体系

20μl反应体系中，模板DNA为120ng，引物浓度为0.3μmol/L，dNTPs浓度为0.15mmol/L，Mg2+

浓度为1.5mmol/L，Taq酶浓度为1.0U。

7.4.2PCR反应程序

94℃预变性5min；前5个循环：94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1min；后40个循

环：94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃保存。

7.4.3PCR产物的处理

PCR结束后，于20μL的反应体系中加入4μL的上样缓冲液，摇晃混匀后，备用。

DB21/T2981—2018

7.5聚丙烯酰胺凝胶的制备

7.5.1玻璃板的清洗

用洗涤剂及抹布擦洗玻璃板（长板和短板），随后用自来水冲洗干净，再将玻璃板用蒸馏水冲洗2

次，最后用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。

7.5.2胶槽装配

7.5.2.1玻璃板的固定

将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭后置于玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确

认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。

7.5.2.2封胶

配制1%的琼脂糖凝胶，彻底煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免

出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，待其室温凝固后进行下一步操作。

7.5.3丙烯酰胺胶的配制

在50mL8%非变性聚丙烯酰胺储备液中加入100μL10%过硫酸铵和200μL四甲基乙二胺

（TEMED)，迅速轻轻混匀。

7.5.4灌胶

将固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，配好的8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓

慢匀速倒入灌胶口中，避免出现气泡，待胶刚要溢出灌胶口时停止灌胶，将梳子轻轻插入灌胶口中，室

温凝固1h以上。

7.5.5上样和电泳

待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，

使用1×TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂直缓

慢将梳子从灌胶口中拔出，并用1×TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用200μL移液器从左至右逐个

对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取5μL处理后的PCR扩增产物上样，

并在胶板的一侧或适当位置的样品槽中加入4μL的DNAMarker(DL2000Marker)作为对照，电泳在

200V稳压，电流300mA条件下进行，电泳时间约为2.5h～3h。

7.5.6卸胶

电泳结束，关闭电源，将上槽中1×TBE缓冲液放出，取下固定的夹子，将玻璃板水平放置，起胶

铲一侧沿灌胶口边缘缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中，使凝胶与玻璃板分

离，取出玻璃板，放净双蒸水。

7.6银染

DB21/T2981—2018

7.6.1固定

将取出的凝胶小心放入装有1L新配制的10%冰乙酸（固定/终止液）的塑料方盒中，置于水平摇

床上80r/min轻摇10min。

7.6.2漂洗

将胶小心转入双蒸水中漂洗2次，每次2min，放净双蒸水。

7.6.3染色

在新配好的500mL硝酸银溶液中加入1.6mL37%甲醛溶液，充分混匀后沿一角倒入装有凝胶的方

盒中，水平摇床上80r/min轻摇10min后，放净染色液。

7.6.4冲洗

在方盒中加入1L双蒸水，脱色摇床上80r/min轻摇30s，倒净双蒸水。

7.6.5显影

将2mL37%甲醛溶液加入提前4℃预冷的500mL氢氧化钠溶液中，充分混匀后沿一角倒入方盒

中，水平摇床上80r/min轻摇至清楚条带显现。

7.6.6定影

将胶小心取出，用双蒸水冲洗一次后迅速放入10%冰乙酸中，水平摇床轻摇3min～5min，放净固

定液。

7.6.7漂洗

在双蒸水中漂洗2次，每次2min。

7.6.8观测

将凝胶轻轻放在白的透明的日光灯观测箱上，用玻璃棒铺平凝胶并赶出气泡，观察和记录电泳结果，

用数码相机进行拍照；或用凝胶成像系统扫描拍照。

7.7谱带记录

选取电泳图上清晰、易于辨认的多态性条带进行记录和统计，根据DNA分子量标准（DNAMarker）

计算出个扩增条带相应的DNA片段分子量大小（近似值），以SRAP引物组合的名称加上DNA片段分子量大

小为后缀对条带进行命名，并分别用“1”和“0”代表“有”带和“无”带的方法仔细记录，获得DNA二维数据

矩阵。

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AA

附录A

（规范性附录）

SRAP（相关序列多态性）标记引物序列

表A.1所用SRAP（相关序列多态性）标记引物序列

引物编号序列（5'→3'）引物编号序列（5'→3'）

me1TGAGTCCAAACCGGATAem1GACTGCGTACGAATTAAT

me2TGAGTCCAAACCGGAGCem2GACTGCGTACGAATTTGC

me3TGAGTCCAAACCGGAATem3GACTGCGTACGAATTGAC

me4TGAGTCCAAACCGGACCem4GACTGCGTACGAATTTGA

me5TGAGTCCAAACCGGAAGem5GACTGCGTACGAATTAAC

me6TGAGTCCAAACCGGTAAem6GACTGCGTACGAATTGCA

me7TGAGTCCAAACCGGTCCem7GACTGCGTACGAATTCAA

me8TGAGTCCAAACCGGTGCem8GACTGCGTACGAATTCTG

me9TGAGTCCAAACCGGTAGem9GACTGCGTACGAATTCGA

me10TGAGTCCAAACCGGTCTem10GACTGCGTACGAATTCAG

em11GACTGCGTACGAATTCCA

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BB

附录B

（规范性附录）

主要试剂的配置

B.10.5mol/LEDTA-二钠（pH8.0）溶液

将18.61g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA-2H2O）溶于80mLH2O中，加入氢氧化钠（NaOH）调

节pH至8.0，用超纯水定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。

B.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液

将24.22g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于160mL水中，用浓盐酸（HCl）调剂pH至8.0，用超

纯水定容至200mL，高压灭菌，4℃保存。

B.35mol/LNaCl溶液

将58.44g氯化钠（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高压灭菌，4℃保存。

B.4CTAB-free缓冲液

CTAB-free缓冲液的成分为250mmol/LNaCl、200mmol/LTris-HCl（1mol/LpH8.0）和50mmol/L

EDTA（0.5mol/LpH8.0）。在600mL水中加入14.6gNaCl，搅动溶解后，加入200mL1mol/LTris-HCl

（pH8.0）、100mL50mmol/LEDTA（pH8.0），定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

B.54×CTAB提取缓冲液

4×CTAB提取缓冲液的成分为4%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、100mmol/LTris-HCl

（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mL去离

子水中加入40gCTAB，搅动溶解后。加入100mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）、40mL0.5mol/LEDTA

（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

B.6TE（pH8.0）缓冲液

取1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL，用水定容至100mL，高压

灭菌，4℃保存。

B.7EB（1mg/mL）溶液

取0.05g溴化乙锭（EB）用50mL水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温保存，工作浓度

为1mg/mL。

B.810mol/LNaOH溶液

称取80mg氢氧化钠（NaOH），先用160mL水溶解后，在加水定容至200mL，高压灭菌，室温

保存。

B.90.8%琼脂糖凝胶的配制

称取0.8g电泳级琼脂糖至于200mL三角瓶中，加入100mL1×TBE电泳缓冲液，在微波炉中熔化

至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50℃～60℃，加入EB（1mg/mL）溶液使其

终浓度为0.5μg/mL，混匀后倒入放好梳子（距底板约1mm）的载版上，凝胶厚度为3mm～5mm，待

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凝胶完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶版上表面。

B.106×DNA上样缓冲液电泳(DNALordingBuffer)

6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（质量分数）溴酚蓝、0.05%（质量分数）二甲苯青、

30mmol/LEDTA、36%（质量分数）甘油和ddH2O。使用时按照每5μLDNA样品加入1μLDNA上样缓冲液

的比例，混合DNA样品和DNA上样缓冲液，直接加到点样孔即可。

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CC

附录C

（规范性附录）

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂

表C.140%丙烯酰氨（acrilamide）贮备液

成分用量备注

丙烯酰氨（acrilamide）380g用400mL去双蒸水加热溶解

甲叉双丙烯酰氨（bis-acrilamide）20g用200mL去双蒸水溶解

最终体积1000mL棕色瓶中室温保存

表C.210%过硫酸铵（ammoniumpersulphate）溶液

成分用量备注

过硫酸铵（ammoniumpersulphate）1g

双蒸水（ddH2O）10mL分装后-20℃保存。

表C.310倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（10×TBE缓冲液）

成分用量备注

Tris碱（Trisbase）108g

硼酸（boricacid）55g

0.5mol/LEDTA（pH8.0）40mL用双蒸水定容至1000mL

最终体积1000mL室温保存

表C.48%非变性聚丙烯酰氨工作液

成分用量备注

40%丙烯酰氨贮备液10mL现用现配

10×TBE5mL

双蒸水（ddH2O）35mL

10%过硫酸铵（ammoniumpersulphate）100μL

四甲基乙二酸（TEMED）200μL

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DD

附录D

（规范性附录）

银染试剂

表D.1固定/脱色液

成分用量备注

冰乙酸（glacialaceticacid）100mL临时配制

双蒸水（ddH2O）900mL

表D.2硝酸银（AgNO3）染色液

成分用量备注

硝酸银（AgNO3）3g

37%甲醛（formaldehyde）1.6mL

双蒸水（ddH2O）500mL临时配制，避光室温保存

表D.2氢氧化钠（NaOH）显影液

成分用量备注

氢氧化钠（NaOH）10g用前在4℃冰箱预冷30min。

37%甲醛（formaldehyde）2mL

双蒸水（ddH2O）500mL临时配制，避光室温保存

_________________________________

目次

前言..............................................................................IV

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3定义与术语.........................................................................1

4仪器和设备......................................................................