DB21-T 2944-2018辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术规程

ICS65.020.01

B21DB21

备案号：60672-2019

辽宁省地方标准

DB21/T2944—2018

辣椒品种纯度

SSR分子标记鉴定技术规程

Regulationsforthepurityidentificationofpepper

varietiesbySSRmolecularmarkers

DB21/T2944-2018

辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术规程

1范围

本标准规定了辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术的仪器设备及试剂，鉴定方法，结果

计算。

本标准适用于辣椒品种一代杂交种子制种过程中由于混入母本种子导致纯度降低的纯

度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本

适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3术语和定义

下列术语及定义适用于本标准。

3.1

品种纯度VarietiesPurity

品种在特征特性方面典型一致的程度，本标准中指品种在SSR分子标记带型方面典型一

致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占供检样品种子总粒数的百分率表示。

3.2

分子标记MolecularMarker

以蛋白质，核酸等生物大分子的多态性为基础，显示生物遗传差异的标记。

3.3简单重复序列SimpleSequenceRepeat（SSR）

又被称为微卫星DNA，是一类由几个碱基（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个

至几百个碱基的串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

3.4

SSR分子标记SSRMolecularMarker

简单重复序列（SSR）在同一物种的不同基因型间具有高度多态性，根据其侧翼的保守

碱基序列设计引物，通过PCR扩增，利用电泳技术获得的多态性带型，即SSR分子标记。

4原理

SSR广泛分布于辣椒基因组中，根据SSR分子标记在遗传上的多态性，共显性等特点，通

过比较辣椒品种单粒种子间在SSR分子标记上一致性程度，可以鉴定品种纯度。

2

DB21/T2944-2018

鉴于生产上一代杂交种子的纯度问题通常由混入母本自交的种子导致。一代杂交种子的

种皮由母本组织发育而来，其基因型为母本基因型，而一代杂交种子的胚由双亲生殖细胞结

合后的受精卵发育而来，其基因型为双亲基因型。因此，一代杂交种子的种皮与胚的DNA不

同，可用于筛选母本与一代杂交种子在SSR分子标记上的差异。

5仪器设备及试剂

5.1仪器设备

恒温水浴锅；PCR仪；垂直电泳槽；电泳仪；万分之一电子天平；移液器；振荡器；高

速离心机；紫外-可见成像系统；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。

5.2试剂

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十六

烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸（H3BO3）；甲叉双丙烯

酰胺；丙烯酰胺；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（APS）；硝酸银（AgNO3）；

甲醛溶液（37%）；PCR预混液（2×TaqPCRMix）；SSR引物等。

5.3溶液配制

相关溶液配制方法见附录A。

6鉴定方法

6.1取样

按照GB/T3543.2规定的方法扦样，从送检样品中随机取不少于105粒种子。

6.2DNA提取

6.2.1样品前处理

取105粒种子，其中100粒种子用于纯度鉴定，以单粒分别置于研钵中，加入液氮后研磨，

将粉末分别置于2mL离心管中；其中5粒种子用于筛选母本与一代杂交种子的差异引物，用去

离子水浸泡16h，分别剥取种皮及胚，将5粒种子的种皮及胚分别混合后置于研钵，加入液氮

后研磨，将粉末分别置于2mL离心管中。

6.2.2细胞裂解

在上述离心管中分别加入1mL裂解液，振荡混匀后，65℃水浴40min，期间每隔10min混

匀一次。

6.2.3DNA沉淀

裂解处理后，12000r离心2min，取上清液600μL移入新的2mL离心管中，加入等体积异

丙醇，混匀后于室温下静置2min，12000r离心2min，弃上清液，在通风橱中开盖放置使异丙

醇挥发。

6.2.4DNA回溶

加入200μL超纯水使沉淀溶解，即得到DNA粗提液。

3

DB21/T2944-2018

注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提

取方法都适用于本标准。

6.3PCR扩增

6.3.1反应体系

10μL反应体系：5μL2×TaqPCRMix（含染料），1μL引物（10μmol/L），2μLDNA，

2μL超纯水，混匀。

6.3.2反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸

5min；4℃保存。

6.4电泳检测

6.4.1凝胶制作

将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。取8%丙烯酰胺胶80mL，加入TEMED80μL和

10%过硫酸铵400μL，迅速混匀后灌胶，灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子轻

轻的插入胶中，15min左右拔下梳子，待凝胶聚合1h以上之后再上样。

6.4.2电泳

每个加样孔加入3μL的PCR产物。80W恒功率电泳至电泳指示剂到达胶板的中下部。

6.5银染

电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取出凝胶，去离子水快速漂洗1次，不超过1min；

染色液中染色15min；去离子水漂洗5min；显影液中轻轻晃动直至带纹清晰；去离子水漂洗

1min。将凝胶置于可见-紫外成像系统拍照。

6.6分子标记筛选

用SSR引物（见附录B）进行PCR反应，扩增送检样品胚及种皮DNA，筛选带型清晰，差异

明显的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。

6.7纯度鉴定

用筛选出来的SSR引物对100粒样品种子的DNA进行PCR扩增，统计具有本品种特异带型的

种子粒数。

7结果计算

用具有本品种特异带型的种子粒数占供检样品种子总粒数的百分率表示纯度，计算公式

如下：

具有本品种特异带型的种子粒数

纯度%100%..........................(1)

供检样品种子总粒数

4

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AA

附录A

（规范性附录）

溶液配制

A.1裂解液

含有100mmol/LTris-HCl（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，2%CTAB，经高

压蒸汽灭菌后使用。

A.2引物稀释

按照引物合成单的说明先配制100μmol/L的储存液，取适量储存液稀释10倍，配制浓度

为10mmol/L的使用液。

A.310倍电泳缓冲液

Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。

A.48%丙烯胺凝胶

先配置30%丙烯酰胺凝胶，取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺1g，定容至100mL。再用1

倍电泳缓冲液将30%丙烯酰胺凝胶稀释至8%。

A.510%过硫酸铵

0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。

A.6染色液

1g硝酸银，定容至500mL。

A.7显影液

500mL蒸馏水中加入10g氢氧化钠和2mL甲醛。

5

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BB

附录B

（规范性附录）

SSR引物

SSR01F5-ATCCCAAAAGGCAAAATC-3

SSR01R5-CCCTTCCACATTCAGTCA-3

SSR02F5-TGATCAGCGGACAAATCT-3

SSR02R5-GGTGACACTGACCCCATA-3

SSR03F5-TCTGGGAATTTTGGAACTGC-3

SSR03R5-TCCAGTTTTGATCATCTCCAAC-3

SSR04F5-ATTGTGATAGCAACCCCTGG-3

SSR04R5-CACAGATGAGGGCACAAATG-3

SSR05F5-ACGCCAAGAAAATCATCTCC-3

SSR05R5-CCATTGCTGAAGAAAATGGG-3

SSR06F5-GACAGTCTTTCAAGAACTAGAGAGAG-3

SSR06R5-TGGAGCAAACACAGCAGAAC-3

SSR07F5-TGACAGCTACCGAAAATGA-3

SSR07R5-CCTCTAATGCTGACGTGAA-3

SSR08F5-TTTGGACCCTTTCCCTAC-3

SSR08R5-GGATCAAGTAGGCGTTGA-3

SSR09F5-CACCATGTAGCATCTGGG-3

SSR09R5-GATGGATGGATCGACAGA-3

SSR10F5-TTTTGATCCCTCGATAAGTCTTT-3

SSR10R5-TCACACCAGACTCAGCCAATTTA-3

SSR11F5-GACGCCGAGGACTATGAT-3

SSR11R5-GCCTCCACCTTTCCACTA-3

SSR12F5-GTCCCAACTAAACAATCCA-3

SSR12R5-CAAACACCAGCAACCATA-3

SSR13F5-CTACGAAGTCCCAACTAAAC-3

SSR13R5-CAAACACCAGCAACCATA-3

SSR14F5-CCATCTGCGACGACAACG-3

SSR14R5-CCAATGCTCCTCCCTCCA-3

SSR15F5-TCAATTTTCTCCGCTACA-3

SSR15R5-GAGGGATAGTTCAGGTTTG-3

SSR16F5-CCATAACCTCCTCCACTT-3

SSR16R5-GACTTGCTATCCTCCCAC-3

SSR17F5-AGGAGCCGATTATTGAGG-3

SSR17F5-TGGGTTCTACGCCAGTTT-3

SSR18F5-TGGACCTAAGTTTGGGTGGAT-3

SSR18R5-TGCTGCCGCTTGGGTATT-3

SSR19F5-GCCGGTATGTCGTCTTCG-3

SSR19F5-GATCGTTCCAGCGTCAGG-3

SSR20F5-GCTTGGCCGAAAGTGAAA-3

SSR20R5-GAATCCCATCCCGTCTCC-3

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前言