体外受精和早期胚胎培养课件

胚胎工程专题三【复习回顾】穿越放射冠穿越透明带穿越卵黄膜原核形成

配子结合顶体反应透明带反应（第一道）卵黄膜封闭作用（第二道）雄原核形成雌原核形成雌雄原核融合形成合子(受精卵)受精胚胎发育受精卵卵裂桑椹胚囊胚（内含囊胚腔）原肠胚（内含原肠腔）胎儿形成（开始分化）孵化3.2体外受精和试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。快速繁殖动物优良品种目的：技术手段：体外受精和早期胚胎培养国产奶牛：年均产奶量3000公斤左右国际良种奶牛：年均产奶量10000公斤左右引进一头良种成年奶牛需要3万－5万元牛的生育率低，一头牛一胎只一个，一生只能生育四五次牛的生育率虽然很低，但是牛的卵母细胞却相当的多，其卵巢中卵母细胞数目要比一生中排卵数多1000倍左右，公牛产生的精子数目就更多了...伟大设想诞生了案例一采集良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养采集良种公牛精子精子体外获能体外受精良种牛体外受精胚胎胚胎移植受体牛良种犊牛成熟期牛屠宰加工厂市场采集卵巢中的卵母细胞借腹怀胎美好设想体外受精、早期胚胎培养先做到的技术主要包括

、

和

等几个主要步骤。概念：采取雌性动物的

和雄性动物的

，使其在

中受精。注：发育的主要场所是母体卵细胞精子试管卵细胞的采集精子的获取受精体外受精对不同动物,采集卵母细胞的方法不同。实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等卵细胞的采集：

最常用的方法是卵巢经过

处理，具体做法是给供体注射

，使一头母畜一次排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子，之后从

中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。超数排卵促性腺激素输卵管卵母细胞的采集和培养大家畜或大型动物，如牛，卵细胞的采集：

从屠宰场已屠宰母畜的

中采集卵母细胞.也可以借助

、

或

等工具确定卵泡位置，直接从活体动物中吸取泡卵液（连同卵母细胞）取出，在体外进行人工培养，使其成熟。卵巢超声波(B超)探测仪内窥镜腹腔镜牛卵巢卵母细胞的采集和培养B超引导法：借助超声波探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有超声波探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞。卵母细胞的采集和培养CO2培养箱内进行培养卵母细胞的成熟培养如何使雌性动物排出更多的卵子促性腺激素处理对于大家畜或大型动物如何采集卵子屠宰场、超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜（活体）采集的卵子是否马上可以受精初级卵母细胞，体外培养至MII中期卵母细胞的采集和培养总结收集精子的方法有：假阴道法手握法电刺激法精子的采集和获能获能处理

培养法：啮齿动物、家兔和猪将取自附睾的精子，放入人工配制的获能液中培养一段时间。化学诱导法：牛、羊将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导，使精子获能。体外受精过程体外受精过程检查受精状况和受精卵的发育能力在体外受精前，要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有

和

两种。对于

、

和

的精子，一般采用培养法；培养法：精子在获能液中获能。

对于

、

等家畜的精子常用化学法。化学诱导法：精子一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导获能。培养法化学诱导法啮齿动物家兔猪牛羊复习人工授精就是体外授精吗？人工受精就是用人工方法将精液注入雌性动物体内，所以受精过程在体内完成。体外受精的受精过程在体外完成。概念：是应用人工创造条件，对获取的进行体外培养。培养液成分：早期胚胎胚胎的早期培养水、无机盐、有机盐、维生素、氨基酸、激素、核苷酸、血清等

不同动物胚胎移植时间不同牛、羊：桑椹胚或囊胚阶段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚阶段试管婴儿：8个或16个细胞阶段胚胎培养发育到适宜阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。牛体外受精胚胎工厂化生产流程图1982年世界首例试管牛犊问世试管动物技术1978年7月25日世界首例试管婴儿1988年3月10日我国首例试管婴儿1992年我国首例三胞胎试管婴儿3.3胚胎工程的应用及前景细胞核移植的方法体细胞核移植胚胎细胞核移植回顾胚胎体外培养技术动物细胞培养技术什么技术什么技术什么技术什么技术什么技术什么技术核移植技术胚胎移植技术胚胎移植概念:

将雌性动物的早期胚胎,或者通过其他方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为新个体的技术。胚胎的来源：

雌性动物的早期胚胎，或通过体外受精及其他方式得到的胚胎。供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。受体的条件：同种、生理状态相同。

胚胎移植是胚胎工程其他技术的最后一道工序。转基因、核移植等优良供体超数排卵发情配种收集胚胎受体母牛正常繁殖或两三个月后做另一次移植同期发情发情胚胎移植妊娠有价值的后裔什么方法？促性腺激素优良公牛牛胚胎移植技术路线示意图怎样做到？注射相关激素同步发情：又称同期发情，利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。优良供体超数排卵发情配种收集胚胎受体母牛正常繁殖或两三个月后做另一次移植同期发情发情胚胎移植妊娠有价值的后裔优良公牛牛胚胎移植技术路线示意图用具有什么特点的牛作为供体牛？遗传性能和生产性能优秀的个体用具有什么特点的牛作为受体牛？健康并能正常繁殖的个体如何收集？

在配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来。冲卵是从输卵管或子宫角取出早期胚胎母牛非手术冲卵示意图冲卵后，对胚胎进行质量检查。这时的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段。将收集的胚胎直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存液氮罐6天收集的胚胎（未拣）方法一：手术法具体做法：引出受体子宫和卵巢，将胚胎注入子宫角，缝合创口。方法二：非手术法将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应部位，注入胚胎。对受体母牛进行是否妊娠的检查受体母牛产下胚胎移植的犊牛供体后代还是受体后代？受体移胚胚胎移植胚胎移植的生理学基础1)供体和受体相同的生理环境；如何保证？供、受体生理状态要相同，为此必须做到A、供、受体母畜的发情时间一致。

哺乳动物发情排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。B、移入受体子宫胚胎的位置应该与其在供体内的位置相同或相似。

移入胚胎一侧的受体子宫对应的卵巢必须有黄体存在。在胚胎移植过程中，受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态。为什么？因为两者之间的妊娠期，体内的激素水平要相同或者接近。否则胚胎就不能正常的着床。这是胚胎移植成功与否的关键。胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。你认为这样的概括正确吗？

正确。胚胎移植的生理学基础1)供体和受体相同的生理环境；2)早期胚胎处于游离状态,为胚胎的收集提供了可能；什么部位？输卵管和子宫角胚胎移植的生理学基础1)供体和受体相同的生理环境；2)早期胚胎处于游离状态,为胚胎的收集提供了可能；3)受体对移入子宫的胚胎基本上不发生免疫排斥；4)胚胎与受体建立正常的联系,但遗传物质没有改变。为什么？指发生了什么生理过程？同物种动物之间进行胚胎移植易于成功。选择供体母牛受体母牛……

处理……超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）胚胎移植的基本程序同期发情总结胚胎移植成功的关键同时发情植入相应部位同物种总结

试管动物胚胎移植动物受精获取生殖细胞试管动物与胚胎移植不同点：体外受精体内自然受精从供体获得卵子和精子获得受精卵或胚胎总结受体母羊与所生羔羊一次移入三枚胚全部成活胚胎移植效果胚胎移植的现状和意义

胚胎移植实现了优良性状个体的繁育，如果我们能确定某个胚胎将发育为非常理想的个体，那么有没有办法让这样的一个胚胎一次性地繁育更多的个体？思考胚胎分割（1）胚胎分割的概念（2）胚胎分割特点（3）胚胎分割的理论基础（4）胚胎分割操作过程1.概念:

采用机械方法（显微手术）将早期胚胎分割成2分胚,4分胚或8分胚,经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎的技术。2.特点：

后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看做动物无性繁殖或克隆的方法之一。3、理论基础

动物胚胎细胞的全能性。所以胚胎分割的时期为：

囊胚或桑椹胚。为什么选择这样的胚胎发育时期？成倍增加胚胎数量4、选择的胚胎：

发育良好的,形态正常的桑椹胚或囊胚。5、使用的主要仪器：

实体显微镜和显微操作仪。6、具体操作

用分割针或分割刀片将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中，或直接将裸半胚移植给受体。发育良好的胚胎切割针/刀或酶处理细胞分散开受体多个受体移植培养液体外培养至囊胚移植胚胎分割操作过程7、操作注意事项：①对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割。原因：内细胞团一般到囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。

若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。7、操作注意事项：

②胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低。早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到；再者，细胞数目是有限的。分割的份数越多，不但难以做到均等分割，每一份的细胞数会越少，而且作为囊胚期的胚胎内细胞团细胞所受的影响会更大。

因此，分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低。受精卵卵裂

早期胚胎胚胎分割基本过程植入植入代孕母牛分割8、胚胎分割技术的缺陷

（1）刚出生动物的体重偏低，毛色和斑纹还存在差异；（2）采用胚胎分割技术产生同卵多胎的可能性是有限的。胚胎干细胞（1）什么是胚胎干细胞？简称是什么？（2）胚胎干细胞的来源。（3）胚胎干细胞的特性。（4）胚胎干细胞的应用。1.概念：

简称ES或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。全能细胞囊胚胎儿内细胞团细胞生殖腺细胞受精胚胎干细胞分离培养分离内细胞团胰蛋白酶处理转入培养皿中培养不加饲养层细胞培养细胞分化饲养层的细胞一般是胚胎成纤维细胞，因为胚胎成纤维细胞可以分泌一些能抑制细胞分化的物质，满足促进干细胞生长的同时抑制干细胞分化的条件。EK细胞加饲养层细胞

培养ES细胞2.特点:

（1）形态：体积小,细胞核大,核仁明显；（2）功能：具有发育的全能性,可分化为成年动物体内任何一种组织细胞;

（3）在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。（1）治疗人类的某些顽症。利用ES细胞可以诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。3.主要用途（2）培育出人造组织器官，用于器官移植。

随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。还有什么技术可以完成此工作？3.主要用途（3）ES细胞也是研究体外细胞分化的理想材料。

ES细胞在饲养层细胞上，或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。在培养液中加入分化诱导因子,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化。3.主要用途基因工程细胞工程胚胎工程操作对象技术手段（操作步骤）理论基础早期胚胎配子胚胎移植体外受精胚胎分割胚胎干细胞培养等哺乳动物的受精卵和早期胚胎的发育规律基因细胞细胞器获取目的基因构建表达载体目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养核移植和克隆动物细胞融合单克隆抗体中心法则细胞全能性细胞膜流动性免疫原理动物细胞培养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素和血清等

胚胎培养液：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等

比较我国首例“虎狮兽”2002年在南京红山动物园诞生，利用了雄虎的精子和雌狮的卵子“体外受精”完成这一过程需要解决的问题①精子在体外用获能物质处理②用化学物质处理掉卵黄膜便于精子进入③抽取精子、卵子的核进行融合④精子入卵后进行人工处理防止多精入卵①练习P81/思考与探究：①对供、受体母畜进行选择，并进行同期发情处理②处理供体母畜③配种或人工授精④收集胚胎