兽医微生物学 第十四章 革兰氏阳性产芽孢杆菌

第十四章

革兰氏阳性产芽孢的细菌第一节芽孢杆菌属

（Bacillus）本属细菌种类繁多，其中炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌为人和动物的病原菌。2炭疽芽孢杆菌

(B.anthracis)炭疽芽孢杆菌惯称炭疽杆菌，是引起人类、各种家畜和野生动物炭疽(Anthrax)的病原，在兽医学和医学上均占有相当重要的地位。

电镜下的炭疽杆菌3

形态及染色特性本菌为G+大杆菌，1.0～1.2μm×3～5μm。无鞭毛，不运动。芽孢椭圆形，位于菌体中央，芽孢囊不大于菌体。可形成荚膜。DNA的G+Cmol%为32.2～33.9。4电镜下的炭疽芽孢5

其形态在动物体内和体外有较大差异：

在体内

1）在动物组织和血液中，此菌单在或呈2～5个相连的短链，菌体矢直，相连的两端平截而呈竹节状，围绕以丰厚的荚膜。

2）荚膜具有较强的抗腐败能力，当菌体因腐败而消失后，仍有残留荚膜显示，称为“菌影”。在猪体内的此菌形态较为特殊，菌体常弯曲或部分膨大，轮廓不清。

3）动物体内的炭疽杆菌只有当暴露接触空气中的氧气之后，方能形成芽孢。

6炭疽杆菌在动物体内的形态78（培养基上的培养物）形态：（1）在培养基中，此菌常形成长链（几十或上百个）；（2）培养18～24h后开始形成芽胞，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央或近中央，直径小于菌体；条件:氧气充足；25--30℃

；中型或碱性环境，易形成芽孢。（3）在普通培养基中不形成荚膜，但若在血液、血清琼脂上或在碳酸氢钠琼脂上，于10%～20%CO2环境中培养则形成荚膜。在体外9炭疽杆菌在动物体外的形态1011此菌为需氧菌，但在厌氧条件下也可生长。可生长温度范围为15～40℃，最适生长温度30～37℃。最适pH为7.2～7.6。营养要求不高，普通培养基中即能生长良好。

培养特性12在普通琼脂上培养24h后，强毒菌株形成灰白色不透明、大而扁平、表面干燥、边缘呈卷发状的粗糙(R)型菌落。无毒或弱毒菌株形成稍小而隆起、表面较为光滑湿润、边缘比较整齐的光滑(S)型菌落。13低倍镜下炭疽杆菌菌落边缘呈卷发样14在血液、血清琼脂平板上或在碳酸氢钠琼脂上，置于5%CO2环境中培养，强毒菌株可形成圆形凸起、光滑湿润、有光泽的黏液(M)型菌落，无毒菌株和类炭疽菌仍保持其粗糙型特点。在血琼脂上一般不溶血，但个别菌株也可轻微溶血。15于普通肉汤中培养24h后，上部液体仍清朗透明，液面无菌膜或菌环形成，管底有白色絮状沉淀，若轻摇试管，则沉淀物徐徐上升，卷绕成团而不消散。在明胶穿刺培养中，细菌除沿穿刺线生长外，四周呈直角放射状生长，整个生长物好似倒立的雪松状。经培养2～3d后，明胶上部逐渐液化呈漏斗状。

16在含青霉素0.5IU/ml的培养基中，幼龄炭疽杆因细胞壁的肽聚糖合成受到抑制，形成原生质体相互连接成串，称为“串珠反应”。若培养基中青霉素含量加至10IU/ml，则完全不能生长或轻微生长。这是炭疽杆菌所特有的，可与其他需氧芽孢杆菌鉴别。

1718生化特性此菌发酵葡萄糖产酸而不产气，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇。能水解淀粉、明胶和酪蛋白。VP试验阳性，不产生叫噪和H2S，能还原硝酸盐。牛乳经2～4d凝固，然后缓慢胰化。卵磷脂酶阳性或弱反应，苯丙氨酸脱氨酶和磷酸脂酶阴性，触酶阳性。不能或微弱还原美蓝。19抵抗力本菌繁殖体的抵抗力不强，在末解剖的尸体中，细菌可随腐败而迅速崩解死亡。

60℃30～60min或75℃5～15min即可杀死。常用消毒剂均能于短时间内将其杀死，如1:5000洗必泰或消毒净、1/10000新洁尔灭、1:50000度米芬在Smin内可将其杀死。对青霉素、链霉素等多种抗生素及磺胺类药物高度敏感，可用于临床治疗。20芽孢的抵抗力特别强大，在干燥状态下可长期存活。需经煮沸15～25min，121℃灭菌5～l0min，或160℃千热灭菌lh方被杀死。实验室干燥保存40年以上的炭疽芽孢仍有活力。干燥皮毛上附着的芽孢，也可存活10年以上。牧场一旦被其污染，传染性常可保持20～30年。21对于曾经掩埋炭疽兽尸的土地，必须加以严格控制。开垦后的头1～2年种植黑麦、三叶草等植物，其根系能分泌一种杀死炭疽杆菌的物质，起到净化土壤的作用。堆肥中的炭疽芽孢，需温度升至72～76℃经过4d方才死亡。常用的消毒剂是新配的20%石灰乳或20%漂白粉作用48h，0.1%升汞作用40min或4%高锰酸钾l5min。炭疽芽孢对碘特别敏感，0.04%碘液l0min即将其破坏，但有机物的存在对其作用有很大影响。22除此之外，过氧乙酸、环氧乙烷、次氯酸钠等都有较好的效果。皮毛消毒可用加有2%盐酸(可使芽孢软化增强消毒效果)的5%食盐水，于25～30℃下浸泡40h，或于室温20～25℃和相对湿度40%～68%的室内，按1:44(W/W)的比例将环氧乙烷与溴甲烷混合，以每立方米空间1.5kg的用量熏蒸24h。23抗原结构炭疽杆菌的抗原主要有：1、菌体多糖抗原--与毒力无关；2、荚膜抗原--与毒力有关，仅见于有毒菌株；3、芽胞抗原--具有抗原性，可用于血清学诊断。24致病性1、可引起人畜共患的急性、热性、败血性传染病。各种动物对本菌的易感性不一；通常：绵羊、牛、鹿最易感——急性败血性死亡，尸僵不全、血凝不良、天然孔出血，臌气；剖检可见脾脏急剧肿胀，比平常大3~4倍，呈典型的败血脾；25马属、骆驼、猪、山羊次之——多为慢性局部感染，如咽部；狗、猫及食肉动物抵抗力较大——多表现肠炭疽；禽类通常无易感性；人类感染则因侵入途径不同而出现皮肤炭疽、肺炭疽、肠炭疽等。262728猪的咽炭疽292、炭疽杆菌的毒力主要取决于（1）荚膜可抑制抗体,抵抗吞噬,使细菌易于扩散和繁殖。30（2）毒素炭疽毒素：主要由3种成分构成:水肿因子（edemafactor，EF）：脂蛋白；致死因子

（lethalfactor，LF）：蛋白质；保护性抗原

（protectiveantigen，PA）：蛋白质，是一种辅酶。这三种成分单独都没有毒性作用，至少要有两种成分协同，才能引起相应作用。31七、微生物学诊断

检验程序如下：32检验时必须注意：病料镜检时一般有荚膜，如无荚膜则不要过早下结论，必须经分离培养后接种实验动物后再进行形态学检查；诊断时注意与炭疽杆菌类似的细菌鉴别，如蜡状芽胞杆菌等；对疑似炭疽杆菌病死亡的家畜严禁剖检，发现后必须首先采血镜检，确认无炭疽杆菌后方可进一步检查。33免疫防治炭疽痊愈动物可获得坚强的免疫，再次感染者很少。抗炭疽血清也可用于治疗和紧急预防，我国目前应用的菌苗有两种。

34系著名微生物学家巴斯德首创，后经改进。方法是将强毒炭疽杆菌培养于42.5℃，丧失形成芽抱的能力。再于35℃培育4～7d，使其形成芽孢的能力重新恢氢培育而成。此菌苗系将培养产生的炭疽芽孢，用30%甘油蒸馏水混悬制成，有效期2年。适用于牛、马、驴、骡、骆驼、绵羊、山羊和猪，一般不引起接种反应。注射后14d即可产生坚强免疫力免疫期一年。1、第Ⅱ号炭疽芽孢苗35是南非兽医研究所选育的一株弱毒变种，失去了形成荚膜的能力。其残余毒力较第Ⅱ号炭疽芽孢苗者强，可杀死小鼠及部分豚鼠，使豚鼠及家兔发生明显水肿，但不致死家兔。有效期2年。适用于牛、马、驴、骡、绵羊和猪，免疫期一年。但是必须注意，此菌苗对山羊反应强烈，可引起严重局部反应，有的甚至发生死亡，故禁用于山羊。2、无毒炭疽芽孢苗36近些年来在研制炭疽亚单位苗，即以不含活菌的炭疽保护性抗原作为免疫原，此苗不但反应好,而且能抵抗强毒炭疽杆菌芽孢经呼吸道的攻击。37系以弱毒菌苗对马或牛先进行基础免疫后，再用强毒炭疽杆菌多次注射而制成。此血清可用于治疗，或在发生炭疽的疫区用作紧急预防。3抗炭疽血清38第三节梭菌属

（Clostridium）是能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏阳性大杆菌。因芽孢常比菌体大，致使菌体呈梭状而得名。绝大多数细菌为专性厌氧菌，又称厌氧芽孢杆菌属。本属细菌中强致病菌约有10种左右，多为人兽共患病原菌。39产气荚膜梭菌

(C.perfringens)形态及染色特性

G+粗大杆菌，无鞭毛，有荚膜，芽胞椭圆形，位于菌体中央或近端，宽度小于菌体40不严格厌氧，营养要求不高，繁殖快（1代8min）血平板双层溶血环（内环β溶血、外环α溶血）生化代谢活跃，分解多种糖、产酸产气，“汹涌发酵”，在牛奶培养基中分解乳糖产酸，使其中的酪蛋白发生凝固，同时产生大量的气体，可将凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，气势凶猛。培养特性与生化41毒素及分型目前为止，至少发现了20种毒素，均为蛋白质。根据其主要毒素的抗原性分A、B、C、D、E5个型，A型为主42致病性致病物质——能产生十余种外毒素，有的即为胞外酶α毒素（卵磷脂酶）——增加血管通透性，溶血、坏死作用，最重要β毒素——组织坏死ε毒素——增加胃肠壁通透性ι毒素——坏死κ毒素（胶原酶）——分解胶原纤维、组织崩解μ毒素（透明质酸酶）——有利细菌及毒素扩散ν毒素（DNA酶）——降低粘稠度，有利扩散θ毒素——溶血毒素、细胞毒素λ毒素——蛋白酶肠毒素——增加肠黏膜细胞通透性43

所致疾病气性坏疽（产气荚膜梭菌为主）创伤感染、伤口条件与破伤风相似潜伏期短8-48h

局部组织坏死，产生大量气体，组织气肿（捻发音），压迫神经末梢，剧烈疼痛并伴有恶臭，最后大块肌肉坏死，毒素入血（毒血症），全身中毒症状，休克、死亡（30%）食物中毒较轻，1-2天自愈坏死性肠炎（C型）

β毒素致病，为出血性肠黏膜坏死（腹剧痛、腹泻、血便、循环衰竭等），死亡率高达40%4445微生物学检查与防治微生物学检查由于气性坏疽发病急剧、后果严重，病原学诊断十分重要直接涂片镜检（G+大杆菌、有荚膜）分离培养鉴定动物试验防治原则——无类毒素特异性预防及时清创、扩创切除坏死组织——截肢大剂量青霉素气性坏疽多价抗毒素46肉毒梭菌

（C.Botulinum）本菌是一种腐生性细菌，广泛分布于土壤，海洋和湖泊的沉积物，哺乳动物、鸟类和鱼的肠道，饲料以及食品中。此菌不能在活的机体内生长繁殖，即使进入人畜消化道，亦随粪便排出体外。当有适宜营养且获得厌氧环境时，即可生长繁殖并产生肉毒毒素。人畜食入含此毒素的食品、饲料或其他物品，即可中毒而发生肉毒中毒症。47肉毒梭菌均能产生肉毒神经毒素（BoNT），简称为肉毒素（botulin），引起人和动物的·肉毒中毒（botulism）。肉毒毒素是一类锌结合蛋白质，具蛋白酶活性，性质稳定，是毒性最强的神经麻痹毒素之一（毒性为KCN的10000倍）。48形态及染色特性本菌多呈直杆状，或略弯曲。单在或成双，革兰氏阳性。周生鞭毛，无荚膜。芽孢卵圆，位于菌体近端，大于菌体直径，使细胞膨大，少数芽孢直径小于菌体，易于在液体和固体培养基上形成芽孢。4950

Rod-shapedBacterium(causesbotulism)Clostridiumbotulinum(SEMx15,400)51

Rod-shapedBacterium(causesbotulism),Clostridiumbotulinum(SEMx12,800)52培养特性本菌为专性厌氧菌。对温度的要求因菌类不同而异，一般最适生长温度为30～37℃，产毒素的最适温度为25～30℃，最适pH7.8-8.2。营养要求不高，在普通培养基中均能生长。在血琼脂平板上，可形成直径1～6mm，圆形到扇状、裂叶状或根状边缘的不规则菌落，扁平或隆起，透明或半透明，灰色至灰白色，常带有斑状或花叶状的中心结构，β溶血。53抵抗力本菌繁殖体抵抗力中等，加热80℃3Omin或l00℃l0min能将其杀死，但芽孢的抵抗力极强，121℃15min才能杀死。54根据毒素抗原性的差异，可将该菌分为A、B、C、D、E、F、G7个型，用各型毒素(或类毒素)免疫动物，只能获得中和相应型毒素的特异性抗毒素。在C型的两个亚型中，Ca毒素只能被本亚型抗毒素中和，Cb毒素则既可被CB毒素中和，又可被CA毒素中和。抗原性及分型55另外，各型菌虽产生其型特异性毒素，但型间尚存在交叉现象，即乙型菌除产生巳毒素外可能还产生少量CB和D型毒素；D型菌也产生少量的巴毒素；E型菌与F型菌能相互产生少量对方的毒素成分。56致病性所有温血动物和冷血动物对肉毒毒素均有感受性，在家畜中以马最为易感，猪最迟钝。在自然情况下，A、B型毒素引起马、牛、水貉等动物饲料中毒和鸡软颈病，C型毒素为各种禽类、马、牛、羊以及水貉肉毒中毒症的主要病因，D型毒素是南非和澳大利亚牛、绵羊肉毒中毒的病因，A、B、E及F型毒素引起人的食物中毒，但G型毒素的致病性还不十分清楚。也见有该菌定殖于创伤或肠道而引起人肉毒中毒症，如婴儿肉毒中毒。另外，F型肉毒梭菌可能与幼儿腹泻有关。57急性中毒，表现为全身痉挛、抽搐，很快死亡肉毒梭菌中毒病58慢性病例头颈无力，反应迟钝肉毒梭菌中毒病59微生物学诊断从可疑媒介物或患病人畜胃肠内容物及血清中检查肉毒毒素，是主要的微生物学诊断手段。1、肉毒毒素检测被检物若为液体材料，可直接离心沉淀；若系固体或半流体材料，须稀释制成乳剂，于室温下浸泡数小时甚至过夜后再进行离心。取上清液分为两份，其中一份按1/10量加入10%胰酶液混匀，于37℃作用60min，然后进行检测。60毒素检出试验取上述两种处理的毒素液，分别腹腔注射小鼠2只，每只0.5m1，观察4d。若有毒素存在，小鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要表现为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。61毒素中和试验分3组进行。检测肉毒毒素可用以A～F型抗毒素致敏的醛化红细胞做间接血凝试验，或用已知型别的抗毒素进行琼脂扩散试验。2细菌分离鉴定：62免疫防治在动物肉毒中毒症常发地区，可用明矾沉淀类毒素作预防注射，有效免疫期可持续半年至一年，也可用氢氧化铝或明矾菌苗接种。人畜一旦出现肉毒中毒症后，可立即用多价抗毒素血清进行治疗。若毒素型别已确定，则应用同型抗毒素血清。63破伤风梭菌

（Cl.Tetani）破伤风梭菌为人畜共患破伤风的病原菌，大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。本病以骨骼肌发生强直性痉挛为主要特征，又称为强直症，所以此菌又名强直梭菌。64形态及染色特性破伤风梭菌菌体细长，长4～8um，宽0.3～0.5um，周身鞭毛，芽胞呈圆形，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。繁殖体为革兰氏阳性，带上芽胞的菌体易转为革兰氏阴性。65Stainedpusfromamixedanaerobicinfection6667培养及生化特性破伤风梭菌为专性厌氧菌，最适生长温度为37℃，pH7.0～7.5，营养要求不高，在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徒扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐