基于网络药理学研究通圣片治疗脑缺血的机制

PAGE1-目录31842_WPSOffice_Level1摘要 118040_WPSOffice_Level1前言 412898_WPSOffice_Level1概述 55069_WPSOffice_Level11.脑卒中研究进展 513571_WPSOffice_Level21.1脑卒中研究概况 58750_WPSOffice_Level21.2发病机制 517591_WPSOffice_Level31.2.1炎症反应 518859_WPSOffice_Level31.2.2脑血管上皮细胞功能异常及酸中毒 513585_WPSOffice_Level31.2.3自由基损伤 61097_WPSOffice_Level31.2.4细胞内钙离子过量 68662_WPSOffice_Level31.2.5凋亡基因的激活 610562_WPSOffice_Level21.3脑卒中临床治疗 611703_WPSOffice_Level31.3.1西医药治疗 624411_WPSOffice_Level31.3.2中医药治疗 78154_WPSOffice_Level12.通圣片研究进展 826316_WPSOffice_Level22.1牛黄 87828_WPSOffice_Level22.2大黄 88084_WPSOffice_Level22.3虎杖 830976_WPSOffice_Level22.4山栀子 85927_WPSOffice_Level22.5赤芍 815968_WPSOffice_Level22.6厚朴 9218_WPSOffice_Level22.7天竺黄 96502_WPSOffice_Level22.8防风 922149_WPSOffice_Level13.网络药理学研究进展 922227_WPSOffice_Level1研究部分 102844_WPSOffice_Level11.研究内容 1031251_WPSOffice_Level12.技术路线图及研究方法 1018276_WPSOffice_Level22.1疾病-药物-靶点网络构建 116082_WPSOffice_Level22.2网络分析 1210468_WPSOffice_Level13.结果 1211576_WPSOffice_Level23.1CIRI-药物-靶点网络 1232193_WPSOffice_Level23.2CIRI-药物-共同靶点网路 139612_WPSOffice_Level23.3TNF通路和细胞凋亡通路网络 163116_WPSOffice_Level14.讨论 1632693_WPSOffice_Level15.结论 1710888_WPSOffice_Level1【参考文献】 1726292_WPSOffice_Level1致谢 1917-基于网络药理学研究通圣片治疗脑缺血的机制【摘要】目的：通过网络药理学预测通圣片（TSTs）治疗脑缺血再灌注损伤（CIRI）的关键靶点和主要通路，探索其治疗CIRI的作用机制，为通圣片的临床应用提供科学依据。方法：首先，在实验前期，采用高效液相色谱法测定了通圣片的11个特征峰，进一步筛选出10种效应成分，然后分别使用ChemDISv2.4和Pubchem生物测定数据库检索出通圣片中10种效应成分的621个潜在靶点；通过开放靶点验证平台，收集了脑缺血再灌注损伤的890个相关治疗靶点；采用Cytoscape软件，将CIRI靶点与药物-靶点网络进一步融合，形成了一个综合性疾病-药物-靶点网络；使用图聚类算法TFIT来识别网络中的功能集群，并使用ReactomeFICentoscape插件的网络丰富了与此相关的路径；最后对网络进行结果分析。结果：通圣片的效应成分与CIRI的相关治疗靶点一共有111个靶点重叠，主要作用于氧化应激的NO和Nrf2通路、炎症相关IL-1β和TNF通路、以及凋亡相关Bcl-2和Cyt-C通路，通过综合调控这些靶点和通路，从而发挥其药理效应，减轻脑缺血再灌注损伤。结论：TSTs治疗CIRI的作用机制与抗氧化应激、抗炎和抑制细胞凋亡有关。TSTs是一种潜在的脑缺血再灌注治疗药物。【关键词】网络药理学；通圣片；脑缺血再灌注损伤ExploringmechanismofTongshengTabletintreatingCerebralIschemiabasedonNetworkPharmacology【Abstract】Objective:TheobjectiveofthisprojectaimstoidentifypotentialactivecomponentsofTongshengtabletandpredicttheirassociationswiththecerebralischemiareperfusioninjury（CIRI）.WehypothesizedthattheactiveelementsofTongshengtabletcouldtargetonthedrivingsignalingofCIRI.Method:Firstly,intheearlystageoftheexperiment,11characteristicpeaksofTongshengtabletsweredeterminedbyHPLC,and10possiblecompoundswerefurtherscreenedout.Next,toidentifythepotentialtargetsofTongshengtablet,621potentialtargetsof10possiblecompoundsinTongshengtabletwereretrievedbyChemDISv2.4andPubchembioassaydatabase,respectively.Toassociatethetherapeutictargetwiththecondition,890relevanttherapeutictargetsofcerebralischemiareperfusioninjurywereretrievedthroughtheOpenTargetsValidationPlatform.UsingCytoscapesoftware,CIRItargetwasfurtherfusedwithdrug-targetnetworktoformacomprehensivedrug-target-CIRInetwork.InextidentifiedcriticalTongshentabletcomponentswhichprobablytargetingCIRIdrivingsignalingbyoverlappingthedrugtargetswithCIRIassociatedproteins.Finally,thegraphclusteringalgorithmTFITwasusedtoidentifythefunctionalclusterswithinthisnetwork,andenrichedthepathwaysimplicatedinthisnetworkusingReactomeFICytoscapeplugin.Results:TheeffectorcomponentsofTongshenTabletmainlyactontheNOandNrf2pathwaysofoxidativestress,theinflammation-relatedIL-1βandTNFpathways,andtheapoptosis-relatedBcl-2andCyt-Cpathways.Bycomprehensivelyregulatingthesetargetsandpathways,Tongshengtabletcanexertitspharmacologicaleffectsandreducecerebralischemiareperfusioninjury.Conclusion:TheroleofTSTsinthetreatmentofCIRIisrelatedtotheanti-oxidativestress,anti-inflammatoryandinhibitionofcellapoptosis.ThisstudysuggeststhatTSTsisapotentialtherapeuticdrugforcerebralischemiareperfusioninjury.【Keywords】Networkpharmacology;TongshengTablets;Cerebralischemiareperfusioninjury前言缺血性脑卒中(Cerebralischemicstoke,CIS)也就是常说的“脑梗死”，目前已经成为一种严重危害中老年人健康的疾病[1]。在CIS的治疗中，有必要恢复或增强缺血区域的血液供应，以尽量减少缺血对中枢神经系统细胞结构和功能的损害[2]。有许多研究表明，如果病情不及时治疗，会进一步损伤脑组织神经，形成脑缺血再灌注损伤（CIRI）。因此，抑制再灌注损伤也是治疗CIS重要的部分之一[3-4]。组织型纤溶酶原激活物（tPA）作为目前治疗CIS的唯一有效药物，其应用时间受到一定的限制，因此许多患者不能及时接受溶栓治疗，从而进一步损伤脑组织，出现不可逆损伤[5]。目前CIRI的药物治疗主要是依靠单一药物，因此，发现一种安全有效的药物治疗CIRI非常重要。通圣片（TSTs）是一种用于急性缺血脑卒中的复方制剂，由大黄、防风、山栀子、牛黄、天竺黄、虎杖、赤芍、和厚朴组成。有研究表明，牛黄具有抗炎，抗氧化作用，还可以通过抑制中枢兴奋起到镇静作用，因此常应用在脑血管疾病的治疗中[6]。大黄具有抗凝血、消炎、利湿退黄等多种功效，对于治疗脑卒中有一定的辅助作用。虎杖通过有效的抵抗自由基过多而引起的损伤，提高脑组织抗氧化的能力从而起到保护脑缺血的作用[7]。赤芍可通过调节机体抗氧化应激能力，从而起到抗CIRI的作用。栀子主要成分栀子苷可通过影响自由基、抑制内皮细胞的损伤和神经保护的作用等来治疗脑血管疾病[8]。厚朴酚和防风的色原酮、多糖等成分都具有明显的抗炎、抗氧化的作用，可以清除体内多余的自由基，保护细胞膜。天竺黄在中医药运用上可用于治疗中风痰壅、热病神昏等脑血管疾病。网络药理学基于系统生物学的理论，从整体的角度去探索药物与疾病之间的关联，通过研究不同的靶标以及作用道路，来明确药物治疗相关疾病的作用机制，实际上是为新药研发提供证据。先是对药物活性分子的筛选以及靶点的确定，然后检索出疾病的相关治疗蛋白，构建药物-疾病-靶点网络，最后通过网络的富集以及分析，挖掘网络中的关键节点，在分子的水平上阐明药物效应成分与疾病治疗靶点之间的效应关系以及潜在机制。而这正好符合中药复方多成分，多靶标协和作用的特点，使得复方发挥疗效具有整体性[9]。因此，网络药理学的应用有利于揭示中药复方在治疗某些疾病上的效应机制，也为未来新药研发指明道路。概述脑卒中研究进展1.1脑卒中研究概况脑卒中（Stroke）俗称为中风，因为多种原因，脑部血管受损导致出血或者阻塞，造成的局灶性或者整体性脑部组织损伤，严重时可致死亡。脑卒中可分为缺血性脑卒中（脑梗死）和出血性脑卒中，其中，据统计缺血性脑卒中占85%左右[10]。当长时间脑部缺血，恢复血液供应时，会产生过量的自由基，攻击这部分恢复血液供应的脑组织，就会形成脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤一旦进展严重，很有可能会发生微血管的损伤或者神经的损伤。在CIRI的发病机制中，主要是有自由基的大量生成、细胞内钙超载、生物膜损伤、由白细胞增加引起的炎症反应、凋亡基因激活等[11]。这些机制相互作用，彼此联系，从而形成恶性的循环，最终导致缺血部位的脑组织不可逆的损伤[12]。而在中医辨证上，脑卒中属于头痛眩晕的范畴中，其病机可以描述为脑供血不足，脑络失和，气虚血瘀，痹阻脉络等[13]。1.2发病机制脑卒中发病机制如是一个级联反应，各种因素相互联系，相互作用，其中包括了炎性反应、脑血管上皮细胞功能异常及酸中毒、自由基损伤、细胞内钙离子过量等。接下来就脑卒中的主要发病机制研究作一综述。1.2.1炎症反应有研究表明，细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）在引起血管疾病中起着重要的作用。当炎性因子大量生成，血管内皮的炎症发生几率增加，大量的活性氧也随之产生，血脑屏障遭到破坏，神经元发生凋亡，最终病情也会越来越严重。而且当炎性因子CPR异常时，患者会出现预后较差的现象，在临床上，病情的症状表现也会比一般患者要严重[14]。1.2.2脑血管上皮细胞功能异常及酸中毒当脑组织出现连续的供氧、供血障碍时，脑血管上皮细胞的自主调节能力就会受到影响，最终导致脑卒中的发生。另外，脑组织的缺氧、缺血状态还会影响线粒体的结构，使其代谢有有氧转化为无氧，产生大量的乳酸，造成脑组织酸中毒甚至导致脑能量耗竭，最终诱导脑组织细胞的死亡[15]。1.2.3自由基损伤发生脑梗死之后，在缺血缺氧的刺激下，细胞膜会释放出花生四烯酸，从而在代谢过程中产圣大量的自由基，自由基进一步进攻脑组织的细胞内皮，使得其功能紊，出现脑细胞坏死，脑水肿等现象，最终诱发脑卒中[16]。1.2.4细胞内钙离子过量细胞内的钙离子超载的损害途径是当大量的Ca2+生成时，会激活磷脂酶A2和磷脂酶C，导致磷膜脂发生降解，产生大量的脂肪酸。而这些脂肪酸在代谢的过程中会导致脑组织的自由基释放增加，使得细胞内皮进一步损害，最终该部位的功能亦受到了影响[17]。另外，当大量Ca2+大量沉积于线粒体时，能量产生受到障碍，也会加重病情[18]。1.2.5凋亡基因的激活与脑卒中发病机制相关的凋亡相关因子主要是Caspases蛋白家族、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）蛋白家族和细胞色素C（cytochromecomplex，Cyt-c）。活化的Caspases蛋白通过影响线粒体膜的通透性，促进凋亡因子的释放，导致脑细胞的凋亡；当促凋亡因子Bax的表达增强，抗凋亡因子Bcl-2的表达被抑制时，脑卒中的细胞就会进入凋亡程序；当Cyt-c因子的表达升高时，也会进一步损伤脑细胞，加重病情[19]1.3脑卒中临床治疗针对以上的发病机制，脑缺血的临床治疗主要是通过抑制炎性因子表达水平，恢复血供能力，清除多余自由基以及保护神经元等来达到治疗作用。目前，在临床上西医药治疗脑缺血主要包括抗血栓药物、自由基消除剂、抗凝和降纤治疗、以及维持神经结构完整性的保护剂等[20]。而在中医药治疗上，主要是以活血化瘀类的药物为主，通过抑制血小板聚集增加血液的流动性从而增加脑灌注量、以及通过提高脑部组织对缺氧的耐受能力。1.3.1西医药治疗1.3.1.1溶栓治疗目前关于缺血性脑卒中（CIS）在急性期的临床治疗最有效以及应用最广的是溶栓治疗及其使用的药物主要有组织型纤溶酶原激活物（t-PA）、重组组织型纤溶酶原激活物（rt-PA）、纤维蛋白溶解剂尿激酶等。而t-PA早在1996年就被美国食品药品监督管理局（FDA）批准为第一个而且是唯一一个用于CIS急性期的的溶栓药物[21]。但是由于这个药物在使用上的各个方面的局限性，使得发生危险副作用的几率大大提高，因此其在临床上的使用是很受限的。1.3.1.2抗血小板聚集治疗抗血小板聚集主要的通过改善CIS患者脑部的血液流动情况，抑制或者治疗血栓的形成，使得血供恢复正常来起到治疗作用。目前临床上抗血栓形成的药物只有氯吡格雷、奥扎格雷和阿司匹林等[22]。1.3.1.3抗凝和降纤治疗抗凝和降纤的治疗机制主要是通过降低血浆纤维蛋白原、溶解血栓以及抑制血栓的形成来发挥作用。常用的药物包括了华法林、肝素、安克洛酶等。但是对于急性期的缺血性脑卒中患者来说，不推荐无选择地早期进行抗凝治疗。所以目前在临床上，这些药物的使用是要根据具体情况个体化使用[23]。1.3.1.4神经保护治疗针对CIS的发病机制，目前临床上伤神经元保护剂主要包括了自由基清除剂、炎症反应抑制剂、钙通道阻滞剂等。其作用机制主要是通过抑制缺血后半暗带区不正常的病理反应，阻断或者延迟发病级联反应的各个过程，起到保护神经元的作用[24]。但是，在临床试验研究中，神经保护剂的治疗均得到阴性结果，多种神经保护剂在CIS的治疗效果仍然缺乏明确的证据。1.3.2中医药治疗中医学对脑卒中的病因病机的认识以及辩证施治原则在治疗中起了重要的作用。通过中医来治疗脑卒中是我国中医学长久积累下来的宝贵财富，有研究表明，不管是单味药的治疗还是复方药的治疗，均在治疗脑卒中这一领域上取得了不错的效果[25]。在单味药的研究中，潘桂生[26]通过提取银杏叶的内酯类化合物以及黄酮类化合物，发现它们具有抗血小板聚集的作用，还可以改善患者脑缺血部位的微循环，恢复血供能力以及抑制血栓的形成，在脑部疾病的治疗中取得良好的效果。王成建[27]在研究中发现在缺血性脑卒中的恢复期出现的气虚血瘀现象，自己研制的益气活血通络方剂治疗效果良好，能够改善凝血指标水平和降低炎性标志物。此外，中医其他疗法在脑缺血治疗上同样取得很好的效果。针灸疗法疗效都比较明确，而且操作的条件也比较简单，安全有效，副作用比较少。有研究表明，在治疗中风神经性瘫痪时，头针联合康复治疗的效果要比单独的康复治疗的效果好很多，总体的有效治疗率达到了90%[28]。通圣片研究进展通圣片(TSTs)是经古方安宫牛黄丸（ANW）和防风通圣散组合的中药复方。TSTs是广东省东莞市中医院成功转化的一种医院制剂，目前在临床上用于治疗头晕、精神错乱和中风等脑卒中相关症状[29]。TSTs是由大黄、防风、山栀子、牛黄、天竺黄、厚朴、赤芍、和虎杖组成。现对方中每一味中药的药理作用一一做综述。2.1牛黄牛黄作为制剂中的君药，在现代药理学有研究表明牛黄通过主要成分牛磺酸稳定细胞膜，清楚氧自由基和调节Ca2+稳态等多种机制，起到保护神经细胞膜，减少细胞凋亡或死亡的作用，从而减缓神经细胞的的衰老和减少细胞的凋亡和死亡[30]。2.2大黄有实验研究表明，大黄的主要活性成分能够通过抑制炎性因子TNF-α和IL-1的基因转录，从而降低脑组织炎性因子的表达水平，起到治疗的作用[31]；此外大黄及其提取物还可以通过降低组织的含水量，减轻CIRI作用，对大鼠脑缺血损伤有保护作用[32]。2.3虎杖虎杖的主要成分为虎杖苷，又称为白黎芦醇（Polydatin,PD）。有研究表明，虎杖苷有较强的抗血小板聚集以及抗血栓形成的作用。此外，虎杖苷还具有较强的抗氧自由基作用，抑制一氧化氮合成酶（NOS）活性，减少一氧化氮（NO）的合成以及氧化作用，保护血脑屏障，减轻或抑制脑水肿的形成，起到保护神经元的作用[33]。2.4山栀子山栀子在治疗CIS中起主要作用的是栀子苷，亦成为京尼平苷（Geniposide）。据研究表明，京尼平苷具有抗炎的作用，在治疗脑血管疾病的多个环节中起着重要的作用，改善脑部的微循环，抑制内皮细胞以及促进神经元保护来提高脑血管疾病的疗效[34]。2.5赤芍在人体中，主要的抗氧物质是超氧化物歧化酶（SOD），有研究表明，赤芍能够提高SOD的活性，减少脂质过氧化物（MDA）以及一氧化氮（NO）的生成，从而起到抗氧化、保护血脑屏障减和神经元、减轻CIRI的作用[35]。2.6厚朴中药厚朴中重要药效成分是一种含有酚羟基的厚朴酚(Magnolol,Mag)，因此它是一种较强的自由基清除剂。同时，厚朴酚还具有强效的抗炎作用，在体内，通过调节相关抗氧物质的表达水平，抑制氧化物的形成，从而保护细胞膜免收过量自由基的损伤，发挥抗局灶性脑缺血的作用[36]。2.7天竺黄同样，有实验研究表明，天竺黄具有抗炎的作用，主要是通过降低TNF-α、IL-1β、细胞间黏附分子-1(ICAM–1）等相关炎性因子的表达，来保护神经以及血脑屏障，对于减轻脑缺血再灌注损伤的伤害有一定的作用[37]。2.8防风药理研究表明，中药防风中的主要药效成分有色原酮类，香豆素类以及多糖类等，具有抗炎、抗氧化的作用。不同的防风多糖表现出不同的抗氧化活性。其中，对于对羟基自由基（·OH）和二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）具有较强的清除能力[38]。因此，防风通过干预脑组织的氧化应激反应，起到保护神经的作用，对于减轻患者的病情具有一定的作用。网络药理学研究进展传统中医药学推崇辨证论治，主要从整体角度去确定疾病的类型，然后用方剂来对症治疗。但是常规的方药含有复杂的成分，使得研究成为了一个棘手的问题。早在2008年，网络药理学由Hopkins[39]提出，这是一种基于系统生物学的研究方法，通过构建药物、疾病以及靶点之间的相互作用网络，来预测药物治疗相关疾病的效应靶点和作用通路。而在中药复方中，药物之间相互配伍，从辨证论治出发，其“整体性”以及“多靶点”的特点是与网络药理学的研究方式是不谋而合的[40]。这也促进了传统复方研究从“单一靶标、单一药物”的原有模式向“网络靶标、多组分药物”模式的转化[41]。如今，网络药理学已经被应用于研究一些疑难杂病发病机制、以及新药研发、相关靶点通路的探测等领域[42]ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kibble</Author><Year>2015</Year><RecNum>26</RecNum><DisplayText>(Kibbleetal.,2015)</DisplayText><record><rec-number>26</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="92vzd2vtgrrdaqexwwa5v0wtfpssz0vsdxee">26</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kibble,M</author><author>Saarinen,N</author><author>Tang,J.</author><author>Wennerberg,K</author><author>Mäkelä,S</author><author>Aittokallio,T</author></authors></contributors><titles><title>Networkpharmacologyapplicationstomaptheunexploredtargetspaceandtherapeuticpotentialofnaturalproducts</title><secondary-title>NaturalProductReports</secondary-title></titles><periodical><full-title>NaturalProductReports</full-title></periodical><pages>1249-1266</pages><volume>32</volume><number>8</number><dates><year>2015</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>。在对于复方中药的研究中，通过网络药理学的方法，还可以更好的对药效物质基础进行研究，将复方中复杂的药效成分及其药理作用，以及潜在靶点进行更加准确的预测[43]。通过分子对接和生物网络识别的应用，可以构建复方中重要成分跟靶点之间的关系网，能够有效的解释复方在治疗一些复杂疾病的作用机制。除此之外，通过数据库获取化合物和疾病相关治疗靶点，利用相关软件构建化合物-疾病靶标-蛋白质网络，通过对网络的富集分析，就可以了解到复方中的某些有效成分通过何种作用机制来治疗疾病。因此，在研究复方中药的过程中，网络药理学的应用，能够对于药效物质基础以及作用机制进行有效准确的研究，也同样使得复方的使用更加有针对性，对于治疗复杂疾病也有更好的效果。虽然目前许多研究集中在TSTs所涉及的草药或其单体上，但关于TSTs全面的研究很大程度上仍然是未知的。同时TSTs的多靶点、多途径的特点也使得研究更加困难。最后本实验采用网络药理学和生物信息学综合分析的方法来预测通圣片治疗CIRI的作用机制。从11种高效液相色谱鉴别的成分中筛选出10种可能的效应成分，利用现有的数据库检索出成分的潜在靶点，再结合CIRI相关治疗靶点，尝试构建一个综合性疾病-药物-靶点网络，通过对网络进行结果分析，进一步确定TSTs在治疗CIRI上的关键靶点和作用通路，发现其治疗的可能机制，为TSTs的临床应用提供科学依据。研究部分研究内容本研究通对通圣片含有的11种成分进行初步筛选，筛选出10种效应成分，利用相关数据库检索出这些效应成分的核心靶点，结合CIRI的相关治疗靶点，构建成分-靶点-疾病网络。通过对网络的分析，预测通圣片治疗CIRI的信号通路，探索其核心靶点和药效生物网络，进一步明确通圣片治疗脑缺血的关键靶点和可能的机制。技术路线图及研究方法图1实验流程图Fig.1Experimentalflowchart2.1疾病-药物-靶点网络构建ChemDIS是一种用来检索成分-蛋白质相互作用的工具，可用于参考成分-疾病之间的关系[43]。PubChemBioAssay[44]是一个小分子数据筛选的仓库，可以提供化合物的生物效应。为了确定通圣片的潜在靶点，分别使用ChemDISv2.4从Stitch数据库v5.0中检索通圣片中11种重要化合物的相互作用蛋白以及使用PubChemBioAssay数据库检索出其生物靶点。在检索时，为了提高置信度，ChemDISv2.4结果的得分截止值设置为0.4。最后将检索出来的成分-蛋白质相互作用和小分子生物靶点均整合到药物靶标网络中，构建化合物-靶点网络，并使用Cytoscape3.6.1软件对该网络进行分析和可视化处理。开放靶点验证平台（TheOpenTargetsValidationPlatform）[45]是一个整合各种证据以帮助药物靶点识别和验证的平台，收集有关疾病的相关蛋白，为已知潜在药物靶点与疾病的关联提供证据。为了将治疗靶点与病情联系起来，先检索了脑缺血再灌注损伤(CIRI)相关的治疗靶点，然后将CIRI治疗靶点与药物的靶标进一步的整合，形成一个综合性的疾病-药物-靶点网络。2.2网络分析明确药物靶点与CIRI疾病的关系，我们提取了10种化合物和CIRI疾病的共同靶点，构建了一个CIRI-药物共同靶点网络。接下来，在Cluster&See[46]中使用图聚类算法TFit(用于迭代转移融合)来识别网络中的功能集群，并使用Cytoscape中的ReactomeFI插件来丰富网络中涉及的通路。图片使用Cytoscape3.6.1.软件做出。结果3.1CIRI-药物-靶点网络在实验前期，对通圣片含有的11种成分进行初步筛选，筛选出10种效应成分，分别是芍药苷（Paeoniflorin）、虎杖苷（Polydatin）、大黄酸（Rhein）、京尼平苷（Geniposide）、大黄酚（Chrysophanol）、厚朴酚（Magnolol）、大黄素甲醚（Physcion）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin）、芦荟大黄素（Aloeemodin）、大黄素（Emodin）。以及使用相关数据库检索出这些效应成分共同调节的621个潜在靶点和CIRI的890个相关蛋白。采用Cytoscape软件将药物靶点和与CIRI的相关蛋白对形成了一个完整的疾病-药物-靶点网络(见图2)。图2疾病-药物-靶点网络Fig.2Disease-Drug-Targetnetwork3.2CIRI-药物-共同靶点网路通圣片的效应成分的相关靶点与CIRI相关靶点有111个靶点重叠，接着我们构建了一个CIRI-药物-共同靶点网络图(见图3)。再通过对网络进行聚类分析，得到了3个主要的功能基团(见图4)。其中芍药苷（Paeoniflorin）、大黄素（Emodin）、虎杖苷（Polydatin）聚类为缺血再灌注损伤组。而大黄酚（Chrysophanol）、大黄素甲醚（Physcion）、大黄酸（Rhein）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin）、厚朴酚（Magnolol）、京尼平苷（Geniposide）等6种成分均聚在另外两组。图3CIRI-药物-共同靶点网络Fig.3CIRI-Drug-CommonTargetnetwork图4在CIRI-药物-共同靶点网络中的功能基团Fig.4functionalgroupsinCIRI-Drug-CommonTargetnetwork3.3TNF通路和细胞凋亡通路网络通过CIRI-药物-共同靶点网络中富集的372条通路，预测这些信号通路可能是通圣片治疗CIRI的潜在靶点。图5A和图5B显示了其中两种具相关度较高而且目前研究较透彻的信号通路：肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和细胞凋亡信号通路。图5TNF通路和细胞凋亡通路网络Fig.5TNFpathwayandApoptosispathwayNetwork讨论TSTs在临床上常用于急性期的CIS。但其对缺血再灌注的作用机制尚不清除。由于通圣片中含有8种中草药，每一种中草药都含有复杂的化合物成分，因此，探讨通圣片治疗CIRI的多靶点、多通路的作用机制有积极的意义。本研究通过在实验前期HPLC指认的11个成分，进一步筛选出10个效应成分，检索出其一共621个潜在靶点，然后检索出CIRI的890个相关治疗靶点，将CIRI治疗靶点与药物的靶标进一步的整合，构建出一个综合性的CIRI-药物-靶点网络，由图2可见通圣片的效应成分作用靶点通过不同的代谢通路，相互联系、协调，从不同的维度提示着治疗CIRI的作用机制。研究表明，随着炎性因子的大量的释放，过量的活性氧也随之产生，神经损伤严重，脑卒中的病情也会随之加重。因此，通过建立CIRI-药物-共同靶点网络，实验结果所示，通圣片治疗CIRI的效应机制可能与NFE2L2、IL-1β、TNF、NOS1、NOS2、NOS3、Bcl-2等靶标基因相关。通过对网络进行聚类分析，其中芍药苷（Paeoniflorin）、大黄素（Emodin）、虎杖苷（Polydatin）聚类为缺血再灌注损伤组，从结果分析可见它们的靶点与CIRI疾病有更多的联系，主要表现在抗氧化以及抗细胞凋亡的机制上，因此，它们更可能是通圣片治疗CIRI的活性成分；而通圣片其余6中成分聚集在另外两组，它们在治疗CIRI上可能有更多相似的作用机制，例如抗炎症反应。通过富集通路，结果分析显示通圣片治疗CIRI的效应通路主要富集在MAPK信号通路、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用等，其中最具代表性的是TNF信号通路以及细胞凋亡通路（见图5）。研究表明，肿瘤坏死因子（TNF）是一种多效细胞因子，与脑损伤相关的血管变化、炎症反应、血脑屏障以及血栓的形成相关。因此，TNF表达上升，往往就会导致脑缺血的形成。因此，实验结果显示，通圣片治疗CIRI的机制之一有可能是通过降低IL-1β和TNF-α来减轻炎症从而发挥治疗作用。同样，相关研究表明B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）的生理功能是阻遏细胞的凋亡，延长的寿命。线粒体中细胞色素C（Cyt-C）的释放可以引起凋亡信号的激活，而Cyt-C的释放是由Bcl-2家族调控线粒体膜透化来调节，因此，在细胞凋亡通路上，通圣片有可能是通过促进Bcl-2的表达，从而降低Cyt-C的表达，从而抑制凋亡中关键分子Caspase3的激活，使得细胞凋亡减弱。通过本实验网络预测分析的结果显示，通圣片的主要成分主要作用于氧化应激的NO和Nrf2通路、炎症相关因子IL-1β和TNF以及Bcl-2和Cyt-C凋亡信号靶点，通过综合调控这些靶点，从而发挥其药理效应，减轻缺血再灌注损伤，发挥神经保护作用，促进神经功能缺损情况的恢复。由于实验的局限性，以及目前对缺血再灌注损伤自噬机制的研究很少，所以在复合靶点疾病网络中，自噬很难被识别，网络分析的结果仍需要进一步的实验验证。结论综上所述，实验研究表明，TSTs在治疗CIRI的作用机制上，各种成分相互协调配伍，在不同的的靶标和通路上发挥着治疗作用，包括减少氧化应激、抑制炎症、调节细胞凋亡。提示TSTs是一种潜在的脑缺血再灌注治疗药物。【参考文献】Morrisblanco,K.C.,Lopez,etal.2017.ImpactofmicroRNAsonischemicstroke:Frompre-topost-disease.ProgressinNeurobiology.Ginsberg,M.D.,2016.Expandingtheconceptofneuroprotectionforacuteischemicstroke:Thepivotalrolesofreperfusionandthecollateralcirculation.ProgressinNeurobiology145-146,46-77.LengT.,ShiY.,Xiong,Z.G.,etal.2014.Proton-sensitivecationchannelsandionexchangersinischemicbraininjury:newtherapeutictargetsforstroke?ProgressinNeurobiology115,189-209.LiuP.K.,GrossmanR.G.,Robertson,C.S.,etal.2001.Ischemicinjuryandfaultygenetranscriptsinthebrain.TrendsinNeurosciences24,581-588.HackeW.,KasteM.,BluhmkiE.,etal.2008.Thrombolysiswithalteplase3to4.5hoursafteracuteischemicstroke.JournalofVascularSurgery48,1634-1635.曹红霞.牛黄及其相关中药制剂脑保护作用的实验研究进展[A].甘肃省中医药学会.甘肃省中医药学会2010年会员代表大会暨学术年会论文汇编[C].甘肃省中医药学会:甘肃省中医药学会,2010:3.黄斌,王兴勇,匡凤梧等.白藜芦醇苷对大鼠局灶性脑缺血的保护作用[J].中国急救医学,2005,25(3):192-193.靳蕊,晋志高.栀子苷治疗脑病的研究进展[J].河北联合大学学报(医学版),2014,16(02):194-196.JinlongRu,PengLi,JinanWang,etal.TCMSP:adatabaseofsystemspharmacologyfordrugdiscoveryfromherbalmedicines.JCheminformatics,2014,16:13.GouriouY.,DemaurexN.,BijlengaP.,etal.2011.Mitochondrialcalciumhandlingduringischemia-inducedcelldeathinneurons.Biochimie93,2060-2067.吕静,姜慧萍,王腾飞等脑缺血再灌注损伤主要发病机制的研究进展[J].滨州医学院学报,2015,38(04):291-293.AmpL.W.,Wilkins,2018.Correctionto:2018GuidelinesfortheEarlyManagementofPatientsWithAcuteIschemicStroke:AGuidelineforHealthcareProfessionalsFromtheAmericanHeartAssociation/AmericanStrokeAssociation.Stroke49,e138.王永炎.中医内科学[M].6版.上海:上海科学技术出版社,1994：24.高俊杰,陈湛愔.脑卒中的临床研究进展[J].现代医用影像学,2017,26(02):337-339+342.TslotouAG，SakorafasGH，AnagnostopoulosG，etal.Sep-ticshock;currentpathogeneticconceptsfromaclinicalper-spective[J].MedSciMonit,2005,11(3):RA76-85.BoneRC,BalkRA,CerraFB,etal.Definitionsforsepsisandor-ganfailureandguidelinesfortheuseofinnovativetherapiesinsepsis[J].Chest,1992,101(6):1644-1655.GhorbaniG.Procalcitoninroleindifferentialdiagnosisofin-fectionstagesandnoninfectioninflammation[J].PakistanJBioSci,2009,12(4):393-396.赵雨娟，刘敬伟.血清降钙素原在感染性休克的诊断中的应用[J].中国实用医药,2014,15(12):111-111.詹宇豪,沈俊明,王智惠等.凋亡相关因子对脑卒中影响机制的研究进展[J].中华灾害救援医学,2015,3(10):588-591.孙瑜，王健，乔夕等缺血性脑血管病与血脑屏障的关系及其临床用药研究进展[J].天津药学,2016,28(03):62-66.段云霞，陈小玉.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[J].中央民族大学学报（自然科学版）,2012,21(2):65-70.宝鲁尔，额尔敦朝鲁.缺血性脑卒中蒙西医治疗现状[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版),2013,28(03):322-324+330+373.陈旭.急性缺血性脑卒中的治疗[J].中华老年心脑血管病杂志,2007,9(9):580-583.傅瑜，廖琴.神经保护剂治疗缺血性脑卒中的研究进展[J].中国新药杂志,2011,20(11):973-977.乔婕，唐巍.中医药治疗脑卒中后肩手综合征的研究进展[J].中国民族民间医药,2015,06:20-23.段云霞，陈小玉.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[J].中央民族大学学报（自然科学版），2012，21（2）：65-70.宝鲁尔,额尔敦朝鲁.缺血性脑卒中蒙西医治疗现状[J].内蒙古民族大学学报(自然