决明子真伪鉴别研究

目录TOC\o"1-3"\u摘要 -25-前言决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子，主要成分为蒽醌类及萘骈吡喃酮类[1]，2015《中国药典》规定大黄酚与橙黄决明素含量分别不能低于0.20%和0.080%，水分不能超过15.0%，总灰分不能超过5.0%，黄曲霉素含量不得超过相关规定[2]。决明子作为民间常用药材之一，拥有悠久药用历史，最早记载于《神农本草经》[3]中，其性状描述与决明、小决明一致，而决明、小决明形态差异极小，因此无法将其区分，猜测古代并未将其两个品种进行区分。通过产地考证发现，决明子主要产于长江以南各省份，北方气候并不适宜，即使引种也无法开花结果。《图经本草》中记载道，“今出广州、桂州”，指的是今天广州与桂林一带。除了国内，决明子还有国外的进口产品，由于基源不同存在差异，进口决明子不能达到《中国药典》要求，同时由于决明子市场已充斥着廉价的进口决明子，决明子价格一直较低，药农积极性较低，所以产量与质量一直不高。本研究以《中国药典》方法为参考，对比决明子正品、伪品及市售不符合中国药典样品的区别，建立一整套可快速准确评价决明子药材质量的方法体系，用于决明子药材的真伪鉴别。概述1中药材决明子及其伪品国内外研究现状和发展趋势随着现代医药观念的进步，人们渐渐认可了中医药在防治各种疾病中的疗效和作用[4]。决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子。主产于河南、安徽、四川等地。其性微寒，味甘、苦、咸，入肝、大肠和肾经，具清肝明目、润肠通便之功，临床常用其生品和炮制品。主治目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、大便秘结等证。现代研究表明，决明子主含蒽醌、吡酮和脂肪酸类等多种化学成分，具有降压、降血脂、保肝、泻下和抑菌等多种生物活性[5]。历代文献资料也早有记载，如《本草纲目》[6]：“除肝胆风热，淫肤白膜，青盲”。可见，决明子不仅具有良好的疗效，也被人们列为药食两用之品。在我国种植分布广、采购来源简单容易、价格低，且提取方便，其保健食品必将拥有广阔的市场前景和经济效益。而其代用品望江南CassiaoccidentalisL.，是苏木科决明属亚灌木状一年生草本植物；性喜高温，不耐寒，野生为主。其性凉味甘苦，有清热解毒、润肠通便、清肝明目的作用。民间常用其鲜叶捣烂外用，可治毒虫、毒蛇咬伤或鳌伤等症。其种子含有毒蛋白表现明显的毒性，具抗原性质。因为毒素的存在，望江南的新鲜种子有微毒[7]。曾经有两位临床的专家[8][9]就有分别报道过有关误食望江南使人中毒的病例。现在望江南子中毒案例逐渐地增多，应加强对望江南子中毒原理的研究。在临床上望江南子非常容易与决明子混淆，这是导致中毒的关键原因。2决明子的真伪鉴别研究现状本次研究以《中国药典》方法为参考，评价不同品种、企业、产地、炮制品、不同价格规格商品决明子质量，建立一整套可快速准确评价决明子药材质量的方法体系。2.1决明子正/伪品性状鉴别决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子。该品略呈四方形或短圆柱形，两端近平行，稍倾斜，长3～7毫米，宽2～4毫米，绿棕色或暗棕色，平滑有光泽，背腹面各有1条突起的棱线，棱线两侧各有1条淡黄色的线形凹纹；质坚硬，不易破碎。横切面可见薄的种皮和2片3形折曲的黄色子叶。气微，味微苦。望江南子为豆科植物望江南CassiaoccidentalisL的干燥种子，其种子扁平状近圆形[10]，一端略长，长3.5～4.5mm，宽2.5～3.5mm，厚1.0～1.5mm。表面灰棕或灰绿色，两平面的中央有类椭圆形凹斑。质坚硬，不易破碎，横切面可见灰白色胚乳与两片平直紧贴的黄色子叶。无臭，味淡[11]。2.2决明子正/伪品显微性状鉴别望江南与决明属的大小决明相比较，其显微结构大体相似：都有支持细胞层、角质层、子叶、栅状细胞层、胚乳及营养层，叶片皆为异面叶、叶中皆有2层栅栏细胞等，但在形状、多少、大小上存在差异；因此可用显微特征来进行两者的鉴别[12]。两者差异主要在于草酸钙簇晶的有无，若药材粉末中不存在草酸钙簇晶，则可推测其粉末并非决明子，决明子粉末中富含草酸钙簇晶，而两者在栅状细胞及支持细胞形态上区别较小，因此粉末显微特征可作为判别决明子真伪的辅助手段[13]。2.3决明子正/伪品TLC鉴定研究药典中要求决明子含大黄酚（C15H10O4）不得少于0.12%，含橙黄决明素（C17H14O7）不得少于0.080%。而望江南子种子中含有大黄酚、β－谷甾醇、胡萝卜苷、大黄素甲醚吡喃葡糖苷、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸等成分[14]；不含橙黄决明素。TLC法在药物分析方面是一个很重要的鉴定方法，且是目前药典中收载最多的鉴别与有关物质检查方法之一[15]，所以可通过TLC鉴定对比不同样品的橙黄决明素斑点的有无区别决明子和望江南子；还可通过对比不同产地来源样品的大黄酚及橙黄决明素斑点亮度不同判断其含量的区别。2.4决明子正/伪品HPLC含量测定目前，国内外关于决明子含量测定的文献报道较多。张毅等教授用HPLC法测定了决明子中7个蒽醌类成分[16]；刘松青等教授用HPLC法测定决明子中决明子苷A、B含量[17]；苏会娟等教授用HPLC同时测定决明子中4个主要成分的含量[18]；唐力英等教授用HPLC测定决明子中红镰霉素龙胆二糖苷的含量[19]；XuLJ等教授用HPLC测定了决明子中8个成分的含量[20]；袁晓等教授用HPLC测定了不同产地决明子中9个蒽醌类成分[21]等等。迄今为止,关于决明子炒制的研究主要进行了炮制工艺的对比研究[22]，以不同的指标测定不同的炮制品总蒽醌或水解后蒽醌类成分含量[23]。方法学的考察表明HPLC法灵敏、准确、快速、简单，可作为决明子的药材质量控制方法之一。不同产地、不同制法的蒽醌类成分含量差别较大，所以可以用大黄酚含量为指标鉴定决明子的质量；同时因望江南子不含橙黄决明素成分，所以可以用橙黄决明素为指标鉴定伪品。研究部分1决明子药材及其伪品的收集收集决明子药材及其伪品，并拍照留存。1.1实验步骤通过互联网采购、药材市场购买及委托顺庆生教授收集等途径，收集不同产地、不同炮制方式、不同品种的决明子药材，同对决明子药材的伪品进行收集。1.2实验结果总共收集样品15批，其中正品13批，伪品2批。两批伪品望江南子分别由顺老提供以及网上购买。13批正品中，分为决明子及小决明两个品种，小决明品种一个批次，为顺老提供。决明子则分为决明子与炒决明子，普通干品有采芝林样品2批次，无限极样品3批次，康美样品2批次，三只松鼠2批次，顺老提供的样品1批次。炒决明子为同仁堂样品2批次。本次收集的决明子样品见表1及图1-1至1-14。表1决明子、小决明子及伪品望江南子样品信息编号名称产地来源时间备注S1决明子广东采芝林2017/6/18图1-1S2决明子广东采芝林2017/6/18图1-2S3决明子河北无限极2017/6/18图1-3S4决明子安徽无限极2017/6/18图1-4S5决明子河北无限极2017/6/18图1-5S6决明子安徽康美2017/9/11图1-6S7决明子安徽康美2017/9/11图1-7S8决明子安徽三只松鼠2017/9/11图1-8S9决明子安徽三只松鼠2017/9/30图1-9S10决明子上海顺庆生教授提供2017/9/30图1-10S11望江南子上海顺庆生教授提供2017/9/11图1-11S12小决明子上海顺庆生教授提供2017/10/12图1-12S13决明子（炒）安徽同仁堂2017/10/12图1-13S14决明子（炒）安徽同仁堂2017/10/12图1-14图1-1决明子（广东-采芝林）图1-2决明子（广东-采芝林）图1-3决明子（河北-无限极）图1-4决明子（安徽-无限极）图1-5决明子（河北-无限极）图1-6决明子（安徽-康美）图1-7决明子（安徽-康美）图1-8决明子（安徽-三只松鼠）图1-9决明子（安徽-三只松鼠）图1-10决明子（上海-顺庆生教授提供）图1-11望江南子（上海-顺庆生教授提供）图1-12小决明子（上海-顺庆生教授提供）图1-13炒决明子（安徽-同仁堂）图1-14炒决明子（安徽-同仁堂）2决明子药材及其伪品外观性状特征通过对决明子药材及其伪品进行外观性状观察，建立一套可用于区分决明子及其伪品望江南子的外观性状方法。2.1实验材料正品决明子；伪品望江南子。2.2实验步骤将决明子正品及伪品望江南子置于白底摄影棚中，进行拍照并对比其外观性状的差异，通过标尺对其相关数据如长度、厚度等进行测量并统计。2.3实验结果2.3.1外观性状描述两者在外观性状上可显著区分，如下图2-1及2-2所示：图2-1决明子外观性状特征图2-2望江南子外观性状特征2.3.2外观性状汇总表表2决明子与望江南子外观性状汇总表品名决明子望江南形状略呈短圆柱形或菱方形，两端平行倾斜。长3-7mm，宽2-4mm。呈扁平状，长3.5-4.5mm，宽2.5-3.5mm，厚1.0-1.5mm。外表面表面暗棕或绿棕色，平滑有光泽。一端较平坦，另端较斜尖，背腹各有一条突起的棱线，两侧各有一条斜向对称色浅的凹纹。表面灰棕或灰绿色，两面中央有类椭圆形的凹斑，有的边缘有白色网格状花纹。质地质硬，不易破碎。质坚硬，不易破碎断面种皮薄，子叶2，黄色，呈S形折曲重叠。种皮薄，子叶2，黄色，不呈S形折曲气味气微，味微苦。无臭，味淡2.4总结通过外观性状总结发现，决明子及其伪品望江南子在外观性状上存在较大差别，除了质地一致外，无论是性状、外表面、断面及气味均存在较大差异，因此，可通过简单的外观性状区分决明子及其伪品望江南子。3决明子药材及其伪品粉末显微鉴定通过对比小决明子、决明子药材及其伪品望江南子的粉末显微特征，总结两者在粉末显微特征上的区别。3.1实验步骤用牙签取已粉碎过的药材粉末适量置于载玻片上，滴加适量透化剂水合氯醛与粉末相混合，在酒精灯上反复透化2~3次，然后滴加适量稀甘油作为封藏剂，盖上盖玻片，避免产生气泡，在显微镜下观察,并进行显微拍照。3.2实验结果3.2.1粉末性状描述由于决明子与小决明子的显微图片特征完全一致，因此本部分图片只展示决明子显微特征图。结果显示，决明子及其伪品望江南子粉末区别较小，在决明子粉末中可见草酸钙簇晶、支持细胞、栅状细胞及角质层碎片。而望江南子粉末与决明子粉末特征类似，最大区别在于望江南子粉末不存在草酸钙簇晶。两者在栅状细胞区别在于长度的差别，而支持细胞区别在于望江南子种皮支持细胞可见两个同心圆圈，内圆多呈红棕色，而决明子内圆则无明显颜色。决明子与望江南子粉末显微特征如下图3-1与图3-2。1.栅栏细胞（a.表面观b.侧面观）；2.支持细胞（a.表面观b.侧面观）；3.角质层；4.簇晶图3-1决明子显微特征图1.栅栏细胞（a.表面观b.侧面观）；2.支持细胞（a.表面观b.侧面观）；3.角质层；4.簇晶图3-2望江南子显微特征图3.2.2决明子药材及其伪品粉末显微特征汇总表表3决明子与望江南子粉末显微特征汇总表品种栅状细胞侧面观支持细胞顶面观角质层碎片草酸钙簇晶决明种皮栅状细胞无色或淡黄色，侧面观细胞一列呈长方形，排列稍不整齐，长42-55μm,壁较厚，厚4-7μm，光辉带两条；表面观类多角形，壁稍皱缩。种皮支持细胞表面观呈类圆形，直径15-24μm，可见两个同心圆圈；侧面观呈哑铃状或葫芦状，长20-30μm，宽20-30μm。无色透明，厚11-19μm。草酸钙簇晶众多，多存在于薄壁细胞中，直径8-21μm。望江南种皮栅状细胞无色或淡黄色，侧面观细胞一列呈长方形，排列稍不整齐，长60-80μm,壁较厚，光辉带两条；表面观类多角形，壁稍皱缩。种皮支持细胞表面观呈类圆形，直径15-24μm，可见两个同心圆圈，内圆多呈红棕色；侧面观呈哑铃状或葫芦状，长20-30μm，宽20-30μm。无色透明，厚11-19μm。无3.3总结决明子与望江南子的粉末显微特征存在差异，差异主要在于草酸钙簇晶的有无，若药材粉末中不存在草酸钙簇晶，则可推测其粉末并非决明子，决明子粉末中富含草酸钙簇晶，而两者在栅状细胞及支持细胞形态上区别较小，因此粉末显微特征可作为判别决明子真伪的辅助手段。4决明子药材及其伪品TLC鉴定研究对不同产地、炮制方式、来源的决明子及小决明，伪品望江南子进行TLC鉴定，区分决明子药材及其伪品。4.1实验材料、仪器与试剂表4-1实验材料材料来源药材见表1大黄酚中国食品药品检定研究院，批号：110796-201621橙黄决明素中国食品药品检定研究院，批号：111900-201605决明子对照品中国食品药品检定研究院，批号：121011-201506表4-2实验仪器仪器来源超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司水浴锅TAISITE公司分析天平赛多利斯科学仪器北京有限公司薄层色谱硅胶H薄层板烟台市化学工业研究所表4-3实验试剂试剂来源甲醇天津市致远化学试剂有限公司，批号：201711324盐酸天津市致远化学试剂有限公司，批号：201711839乙醚天津市致远化学试剂有限公司，批号：201711125三氯甲烷天津市致远化学试剂有限公司，批号：201711034乙酸乙酯天津市致远化学试剂有限公司，批号：2017110574.2实验方法4.2.1供试品的制备按照2015版《中国药典》决明子项下的薄层内容，对所收集的样品进行提取，来源相同的样品选取其中1个批次进行提取，方法如下：图4-1供试品的制备方法流程图4.2.2标准品的制备另取橙黄决明素、大黄酚对照品，加入无水乙醇-乙酸乙酯（2:1）制成1mL含对照品1mg，作为对照品溶液。4.2.3实验方法图4-2TLC实验方法流程图供试品色谱中，在对照品色谱相应位置上，显示相同颜色。4.3实验结果如图4-3所示，通过薄层色谱图可见，各决明子正品样品斑点清晰，无拖尾现象；通过对比对照品薄层图谱发现，决明子正品样品（3至9号，11号）在相应位置上有橙黄色斑点，表明所有决明子正品均含有橙黄决明素及大黄酚；伪品望江南子（10号）只在大黄酚标准品相应位置上有橙黄色斑点，并不含有橙黄决明素；通过薄层图谱，可将正品决明子与伪品望江南子区分。大黄酚；2.橙黄决明素；3.决明子（安徽）；4.炒决明子（安徽）；5.小决明子（上海）；6.决明子（河北）；7.决明子（上海）；8.决明子（安徽）；9.决明子（广东）；10.望江南子（上海）；11.对照药材图4-3各样品薄层鉴别色谱图4.4总结在正品决明子样品中，3号至7号及11号五个样品的大黄酚斑点清晰明亮，而8号、9号两个样品大黄酚斑点较暗，表明其大黄酚含量较前者低。而通过对比不同样品的橙黄决明素斑点可发现，4号至9号、11号样品斑点清晰，颜色较深，而3号样品则斑点颜色较浅。通过对比发现，不同产地来源样品的大黄酚及橙黄决明素斑点亮度不同，下一步通过高效液相色谱法对此两种成分进行含量测定，以期找出其中规律。5决明子药材及其伪品HPLC含量测定对不同产地、炮制方式、批次的决明子及小决明子，伪品望江南子按照2015版《中国药典》决明子项下条件进行含量测定，根据含量测定结果，区分决明子及其伪品望江南子，并通过含量测定，对不同产地、炮制方式及批次的决明子，小决明子根据《中国药典》中所规定的指标性成分含量进行测定，对比其品质优劣。5.1实验材料与试剂乙腈（德国默克公司）；其余实验材料、仪器、试剂同表4-1、表4-2、表4-3。5.2实验方法5.2.1样品水分含量的测定取决明子药材，使用粉碎机进行粉碎处理，并过三号筛，得到决明子粉末，取粉末适量，在热重分析仪中对其水分含量进行测定；5.2.2对照品的配置精密称取取大黄酚、橙黄决明素对照品3.0及2.0mg，定容至10mL容量瓶中，充分溶解，摇匀，配成300及200μg/mL的对照品准备液，吸取对照品准备液1mL，定容至10mL容量瓶中，将大黄酚及橙黄决明素对照品稀释至30及20μg/mL浓度，使用0.22μm微孔滤膜过滤至液相瓶中备用。5.2.3供试品溶液的配置图5-1供试品溶液配制方法流程图5.2.4色谱条件与液相系统条件液相柱为AngilentXBDC18，流动相条件为乙腈-0.1%磷酸溶液。按照表5-1中条件进行梯度洗脱，检测波长为284nm。理论塔板数按橙黄决明素峰计算，不低于3000。表5-1液相色谱条件时间流动相（A）流动相（B）0~15406015~3040→9060→1030~4090105.2.5含量测定方法对所有决明子样品中的大黄酚及橙黄决明素含量进行测定，其计算公式如下:5.3实验结果5.3.1水分测定结果水分测定结果表5-2所示，所有样品的水分含量均低于2015版《中国药典》决明子项下的12.0%的要求，因此所有样品的水分含量均达标。表5-2各样品的水分含量样品来源水分含量（%）采芝林11.95采芝林21.97决明子1.98康美12.18康美22.19三只松鼠12.47三只松鼠22.05同仁堂11.6同仁堂21.59望江南子10.81望江南子20.91无限极11.2无限极23.21无限极32.93小决明2.05对照药材1.885.3.2含量测定结果含量测定结果如表5-3所示，结果表明，所有样品均含有橙黄决明素与大黄酚两种成分，而两个批次的伪品望江南子则不含或含量及其低。在所有决明子及小决明子样品中，橙黄决明素的含量范围为0.824~2.432mg/g，含量较高的样品批次为采芝林及三只松鼠的样品，其次是无限极的决明子样品，含量较低的样品为康美及同仁堂，由顺庆生教授所收集的决明子与小决明子含量最低。在所有的决明子与小决明子样品中，大黄酚含量范围为0.599~8.004mg/g之间，其中，康美的样品大黄酚含量最高，其次则是无限极及同仁堂的样品，顺庆生教授收集的决明子与小决明子大黄酚含量均较高，而采芝林及三只松鼠的样品大黄酚含量则较低。所有的正品样品橙黄决明素的含量均达到药典要求的标准，而采芝林、三只松鼠及对照药材的大黄酚含量未达标。表5-3含量测定结果样品来源橙黄决明素(mg/g)大黄酚(mg/g)采芝林12.4320.730采芝林22.3490.599决明子0.8774.464康美10.9088.004康美20.9037.994三只松鼠12.2661.608三只松鼠21.4901.159同仁堂11.0493.962同仁堂20.9665.325望江南子10.0100.141望江南子20.0100.147无限极11.3274.236无限极21.3444.166无限极30.9182.967小决明0.8243.356对照药材0.4021.1925.3.3所有样品液相色谱图1.橙黄决明素；2.对照药材；3.小决明子（上海）；4.决明子（安徽-无限极）；5.决明子（河北-无限极）；6.决明子（河北-无限极）；7.望江南子（上海）；8.望江南子（网上购买）；9.炒决明（安徽-同仁堂）；10.炒决明（安徽-同仁堂）；11.决明子（安徽-三只松鼠）；12.决明子（安徽-三只松鼠）；13.决明子（安徽-康美）；14.决明子（安徽-康美）；15.决明子（上海）；16.决明子（广东-采芝林）；17.决明子（广东-采芝林）图5-2各样品液相色谱图图5-2所展示的是所有样品、标准药材及标准品的HPLC色谱图，从图可知，所有决明子及小决明子样品均含有橙黄决明素（11.06min）及大黄酚（32.176min）两个色谱峰，而两个批次的伪品望江南子则基本在此两个保留时间位置没有明显的色谱峰，因此，使用HPLC含量测定方法可区分决明子及其伪品望江南子。5.4总结2015版《中国药典》中规定，决明子饮片水分不得大于12.0%，大黄酚及橙黄决明素含量不得低于0.12%及0.08%，即两者含量分别不能低于1.2mg/g及0.8mg/g。在所有样品中，采芝林样品大黄酚含量低于规定值，而所有样品的橙黄决明素含量均合格。从样品含量上看，采芝林样品的橙黄决明素含量远高于大黄酚含量，而三只松鼠的决明子样品的橙黄决明素含量与大黄酚含量接近，橙黄决明素含量大于大黄酚含量。而其他样品如顺庆生教授收集的决明子、小决明子，其大黄酚含量均远高于橙黄决明含量，康美、同仁堂及无限极所收集的决明子样品，也有类似情况。以此推断，不同来源的决明子样品，其橙黄决明素含量与大黄酚含量的比值存在一定的规律。在所有样品中，采芝林样品橙黄决明素含量远高于大黄酚含量，两者比值大于3：1，其样品来源于广东，因此推断，广东来源的决明子与其他产地的存在差异。而康美样品、同仁堂样品、无限极一个样品及三只松鼠的样品来源于安徽，但其橙黄决明素与大黄酚含量比值存在差异，三只松鼠的橙黄决明素与大黄酚比值小于1，可能此产地的决明子实际上来源于广东。在这些样品中，同仁堂来源样品为炒决明子，与决明子样品相比，其大黄酚及橙黄决明素