胆囊肿瘤临床病理学特征研究进展

2022胆囊肿瘤临床病理学特征研究进展摘要因独特的流行病学特征、女性倾向、难以早期诊断以及缺乏有效治疗手段等特点，胆囊癌备受关注。随着胆囊癌前病变的诊断标准和专家共识逐渐成熟完善，胆囊癌过度诊断已逐渐被避免，同时一些浸润性癌也得到了更准确的定义。病理学诊断是确定肿瘤性质和进展程度的关键证据，关系到病人的预后及综合治疗方案的评估。准确的病理学诊断对胆囊癌治疗至关重要，尤其是规范化的取材。胆囊癌在全球所有恶性肿瘤中占1.2%［1］。基于“中国胆囊癌研究小组”(CRGGC)的一项全国性多中心回顾性队列研究(No.NCT04140552)中发现，3528例胆囊癌病人的5年总体生存率为23.0%，其中可切除肿瘤病人的5年生存率为39.6%，晚期未手术病人为5.4%，姑息性手术病人为4.7%［2］。胆囊癌在所有胆道肿瘤中最常见，女性比男性更易发病，伴有慢性炎症的胆囊结石是胆囊癌的危险因素，症状与胆绞痛及慢性胆囊炎的临床表现相似，容易被忽视［3］。根据TNM分期制定最佳的手术方案对提高病人生存率和改善病人预后具有重要指导意义［4］。2021年的一项多中心回顾性研究中发现，全国26家医院病理学报告中存在“浸润全层”、“侵及全层”、“达全层”等模糊描述［5］。这些病例在胆囊癌根治性切除的病人中占19.86%，肿瘤是否突破浆膜层的不确定性导致该研究难以明确肿瘤T分期［5］。同时研究中还发现，对于手术切除标本中肿瘤在胆囊中的相对位置、是胆管切缘还是肝脏切缘、区域淋巴结分组和数量，很多报告中也未明确描述［5］。病理学诊断是确定肿瘤性质和进展程度的关键证据，关系到病人的预后及综合治疗方案的评估。因此，早期、准确的诊断对于潜在的胆囊癌治疗至关重要。本文将重点对胆囊癌前病变和恶性上皮性肿瘤的临床病理学特征及最新进展进行综述。1癌前病变癌前病变的诊断具有重要意义，其不仅为理解肿瘤发生提供重要依据，而且为高危人群的筛查并防止肿瘤早期进展提供机会。第5版WHO消化系统肿瘤分类在良性肿瘤和癌前病变中，把胆管上皮内瘤变（biliaryintraepithelialneoplasiaBillN）分高级别和低级别两类，囊内（胆囊）或导管内（胆管）乳头状肿瘤也被分为低级别和高级别两类，去除了黏液性囊性肿瘤伴低或中级别，以及高级别上皮内瘤变及与其相对应的相关性浸润性癌，新增了囊内或导管内乳头状肿瘤伴浸润性癌。由于在癌前病变的诊断中存在主观性，近十年，智利、美国以及韩国等该领域的病理学家在多次国际多学科共识会议中，建立了统一标准［8-9］。以下对常见癌前病变进行介绍。1.1低级别BillNBillN见于胆道系统［10］及胆囊［11］；但大多数病理医生仍习惯用“异型增生”作为术语。传统的“平坦型异型增生”，也称为胆囊的BilIN,是胆囊癌最常见的癌前病变。“低级别异型增生”的定义和特征是模糊的。1.1Roa等［11］对低级别异型增生组织学特征达成共识，即细胞结构轻度异型，主要是平坦型生长模式，典型的细长核，假复层和核深染；细胞核增大且不规则，但仍局限于细胞的基底部分；低级别异型增生的病例通常没有溃疡。诊断低级别异型增生，至少4〜6个蜡块，因为它可能伴随高级别异型增生［11］。1.2高级别BilIN第5版WHO消化系统肿瘤分类中指出该类病变肿瘤细胞局限于上皮细胞，类似高级别异型增生/胆管上皮内瘤变3级（BilIN-3）。这些病变形态结构复杂，侵袭性高，普遍称为“早期胆囊癌”。该类病变未侵犯肌层（pT2）的病人10年生存率＞90%［9,12］。高级别上皮内瘤变的组织学特征是上皮细胞的极性丧失，核浆比显著增加，以及呈不规则核。通常，高级别不典型增生/原位癌累及上皮全层。形态上包括平坦型，波状、微乳头、高乳头、管状或齿状上皮［11］。因此，息肉和病变的大小是主要的诊断标准（见1.3胆囊内肿瘤部分）［13］。高级别BilIN有多种细胞表型，包括胆道型、肠道型和胃型［14］。大多数病例为胆道型，其特征是大的立方细胞，具有丰富的细胞质，中央或基底核，大核仁，染色质相对较少。肠型发育不良具有与结肠腺瘤相似的特征，如嗜碱性和假复层状、雪茄状的细胞核。BilIN-3在切缘阴性的胆囊切除术后可达临床治愈。如果在胆囊切除术标本中发现BilIN-3病例无浸润性癌成分，则需要广泛和完整的取材。1.3胆囊内肿瘤胆囊内肿瘤（intracholecysticneoplasms,ICN）是上皮内肿瘤（肿块或息肉形成前的侵袭性癌前病变）。本质上，是胰胆道“导管内肿瘤”的胆囊部分。在第5版WHO消化系统肿瘤分类中，被分为“幽门腺腺瘤”和“胆囊囊内乳头状肿瘤”［11］。该类病例有以下特点：易发生在老年人，通常60岁左右，女性是男性的2倍。与其他类型的胆囊肿瘤相比，胆囊结石在ICN中较少见。在临床上约10%被漏诊，可能是因为被误诊为胆结石或淤泥［13］。大体形态上，ICN的特征是颗粒状、疣状或外生性生长。多是弥漫性的，而有些肿瘤很容易从表面脱落。肿瘤中位大小为2.2cm［13］。镜下，病变部位与邻近黏膜结构明显不同，由乳头状、管状或管状乳头状上皮构成，有时，ICN延伸至R-A窦（Rokitansky-Aschoffsinuses），类似浸润性癌，邻近黏膜常表现为平坦型异型增生［13］。根据上皮细胞异型性程度，ICN分为低级别和高级别［15］。低级别ICN仅显示轻至中度异型。高级别的特点是结构复杂、多形性核和极性的丧失［13］。在超过一半的ICN中发现浸润性癌，特别是在乳头状生长（囊内乳头状肿瘤）和高级别异型增生的病变中［13,16-17］，浸润性癌通常是普通管状（胰胆型）腺癌，少数为黏液性、腺鳞状或神经内分泌癌（neuroendocrinecarcinoma,NEC）[18]o非浸润性ICN病人的5年生存率为78%,浸润性癌病人5年生存率为60%[13]oICN可能会增加其余胆道发生肿瘤的风险，因此，此类病人手术后需要长期临床随访[19]o2恶性上皮性肿瘤第5版WHO消化系统肿瘤分类较第4版在胆囊恶性上皮性肿瘤分类中改动不大，第5版中腺癌亚型保留非特殊类型、肠型、透明细胞癌、黏液腺癌，新增了低黏附性癌，并把黏液性囊性癌伴浸润性癌、囊内乳头状癌伴浸润性癌列入腺癌；去除了杯状细胞类癌和管状类癌[6-7]（表3、4）。90%以上的胆囊癌是腺癌[11]o大多数胆囊癌腺癌起源于胆囊底（60%），其次是体（30%）和颈（10%）[20]o大体形态肿瘤类型不同形态结构也不同。大多数腺癌表现为溃疡或菜花型外观。ICN引起的癌表现为息肉样/乳头状管腔状，主要鉴别标准是息肉样或乳头状肿块结构[13]o玻璃样变性胆囊炎引起的肿瘤通常表现为硬化萎缩，有时在胆囊壁中形成珠状结节[21]黏液性癌常是凝胶性的[22]o肉瘤样癌常为息肉样[23]opT1或pT2病例，取材应为整个胆囊，并体现在病理学报告中[24]因为pT1病人通常是可治愈的[9]，病灶浅表或未穿透浆膜的pT2病人也有相当好的预后，而侵及肝脏面的肌周结缔组织，未进入肝脏即pT2b则侵袭性更强[11]o对于pT2b病例，需要多取材来确定是否侵犯肝表面，若已侵入肝脏和或一个邻近器官或结构，则已达到pT3分期［11］。组织学特征腺癌（非特殊类型）在显微镜下，腺癌的特征是恶性腺体弥漫在致密的纤维增生性间质中（图1）。根据腺体分化程度，将腺癌分为:高分化（1级，>95%的腺体成分），中分化（2级，50%〜95%的腺体成分）和低分化（3级，5%〜<50%的腺体成分），以及未分化的无腺体结构（4级）。典型的免疫组化（immunohistochemical,IHC）检查结果为：CK7、MUC1、CEA、CA19-9和CK20表达［25］。突触素和嗜铬粒蛋白阳性的神经内分泌细胞在腺癌中很常见，但不同于神经内分泌瘤（neuroendocrinetumor,NET）［25］。研究发现腺癌细胞失去了抗原提呈的MHCII分子，可转化为鳞癌细胞［26］（图2）。胰胆管型腺癌大多数胆囊癌属于这一类型，因为其在显微镜下与胰腺和胆管腺癌相似，所以被称为胰胆管型。胰胆管型腺癌由管状结构组成，细胞呈立方体或柱状排列，周围是丰富的胶原化纤维增生性间质。一些胰胆管型腺癌分化非常好，而另一些表现为大的腺管，有实质性乳头状和（或）筛状结构的病例难以诊断［11］。胞质可能存在黏液和泡沫细胞［27］。2.2.3肠型腺癌肠型是一种腺癌变体，其组织学外观与结肠腺癌相同，由管腔坏死的腺体、杯状细胞和结肠型上皮细胞组成。肠型腺癌常表现为管状结构、高柱状细胞和细长的假复层核，类似结肠腺癌，但在胆囊中非常罕见［13,22-23,28-29］。有文献报道大多数具有这种形态的病例往往是从管状胃肠道转移而来［11］。2.2.4透明细胞癌透明细胞腺癌(clearcelladenocarcinoma，CCA)是由透明细胞构成，这些细胞含丰富糖原的透明胞浆、细胞核深染和明确的细胞界限。细胞可呈巢状、实心片状和小梁状排列。该类型需要与转移性肾透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinomQRCC)、透明细胞癌和副神经节瘤进行鉴别诊断［30-31］。与胆囊的CCA不同，CRCC是CK7-/CEA-和Vimentin+/CD10+。胆囊的透明细胞癌是一种异常罕见的肿瘤，主要发生在希佩尔-林道(VonHippelLindau，VHL)综合征中，其中抑制素蛋白弥漫阳性，神经内分泌标记物呈阳性。而表达于支持细胞的S1蛋白，副神经节瘤的神经内分泌肿瘤细胞阳性［32］。黏液腺癌只有2.5%的胆囊癌符合黏液腺癌(细胞外黏液占肿瘤细胞的50%)［22］(图3)。黏蛋白中可能存在印戒细胞。黏液癌有独特的临床病理学特征：女性少见，临床表现为“急性”症状，多为晚期肿瘤(87%为T3)和侵袭性高［29］。而且，大多数黏液癌是混合型，合并其他亚型的细胞结构，如胆道型腺癌或低黏附性癌。IHC结果表达：CK7(57%)、MUC1(57%)、MUC2(86%)、MUC5AC(86%)、E-cadherin缺失(86%)、CK20(29%)、CDX2(14%)和MUC6(0%)。该亚型不同于胆囊腺癌（MUC2,1%），胰腺胶体瘤（CDX2-/MUC1+）,乳腺胶体瘤（MUC6-），肠道的黏液腺癌（CDX2-/CK20-/CK7+，微卫星稳定）［29］。腺鳞癌在胆囊癌中有5%以上发现了局灶性鳞状细胞分化［29］。如果鳞状成分占肿瘤细胞25%以上，则该肿瘤可被归类为腺鳞癌［29］（图4）。鳞状成分小于25%的肿瘤被认为是具有局灶性鳞状分化的腺癌。任何以鳞癌为主的病变中存在腺体分化都属于腺鳞癌的范围。腺鳞状癌并不常见，占所有胆囊癌的4%［33］。然而，单纯性鳞状细胞癌极为罕见，仅占所有胆囊癌的1%［11］。鳞状成分常表达p63和高分子量角蛋白，而腺癌成分常产生黏蛋白，表达CEA和B72.3。腺鳞癌或鳞状细胞癌的总体预后比普通型胆囊癌更差［34］。肿瘤的早期肝脏或邻近器官侵犯率增加［33,35］。笔者团队前期研究发现KRTDAP和FAT2可作为胆囊癌中腺鳞癌的诊断性生物标记物［36］。未分化癌未分化癌是一类侵袭性的胆囊癌，在组织学上缺乏明确的分化方向（图5）。胆囊未分化癌可分为两类［11］。但都合并腺癌成分：（1）上皮样。实性（非腺性）上皮样结构。可能有髓样、肝样或横纹肌样模式。前两种情况可能存在错配修复蛋白的表达缺失，而后者可能存在INI/BAF-47的表达缺失和（或）SMARC基因的突变［11］。（2）肉瘤样或纺锤体细胞。其中一些上皮样结构多见，而另一些则由更多的梭形细胞组成。也会出现血管肉瘤样病变。在胰腺中，大多数肉瘤样癌显示破骨细胞样巨细胞，而在胆囊肉瘤样癌中出现破骨细胞样巨细胞是极其罕见的。通常这类病例肿瘤直径较大或多为晚期［11］。有研究表明，该类肿瘤侵袭性强、死亡率高［23］。低黏附性癌低黏附性“印戒”）癌的特征是黏附性差（单个细胞或索状浸润，有或无印戒细胞），肿瘤细胞占50%以上［11］。＜5%的胆囊癌被诊断为低黏附性癌。这类肿瘤在诊断时往往是晚期（PT3+）肿瘤，预后差，较普通胆囊癌更具侵袭性［37］。神经内分泌肿瘤神经内分泌肿瘤（neuroendocrineneoplasms，NEN）是一组异质性的罕见肿瘤，约占所有恶性肿瘤的2%，占所有新诊断恶性肿瘤的0.5%［38-39］。NEN通常起源于神经内分泌细胞，这是一种特殊的细胞，接收神经元的输入，合成和分泌激素，从而连接机体的神经和内分泌系统。神经内分泌细胞位于身体各个部位，主要在下丘脑和脑垂体，以及胃肠道和呼吸道；因此，NEN可以起源于身体的任何器官［40］。NEN的分类、分级和分期可因原发肿瘤部位、增殖、侵袭和转移程度而有所不同［40］。胆囊的NEN最新分类是基于WHO，将NEN分为NET和NEC。分化良好的肿瘤被称为NET，可以是低级别（G1），有丝分裂计数＜2/10个高倍视野（highpowerfield,HPF）和Ki-67指数＜3%；中等级别（G2），有丝分裂活性为2~20/10个HPF，Ki-67指数3%~20%；高级别（G3），Ki-67指数＞20%［40］（图6）。低分化神经内分泌癌（poorlydifferentiatedneuroendocrinecarcinomaPDNEC)可以进一步分为小细胞、大细胞或混合NEC。神经内分泌和非神经内分泌成分＞30%的肿瘤被称为混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤(mixedneuroendocrine-non-neuroendocrineneoplasms，MiNEN)［41］。大细胞神经内分泌癌(largecellneuroendocrinecarcinomas,LCNEC)是NEC的高级别亚群的一部分，是极其罕见和具侵袭性的。组织学上，这些肿瘤与分化良好的NET相似，具有小梁或类器官生长模式，“盐和胡椒”染色质，和(或)栅栏状，以及高有丝分裂活性和大面积坏死的特征［42-44］。与小细胞神经内分泌癌(smallcellneuroendocrinecarcinomas，SCNEC)不同，LCNEC中的细胞通常要大2~3倍，具有明显的核仁和较低的核浆比［45-47］。诊断通常依赖IHC检测神经内分泌标记物，最常见的是突触素、嗜铬粒蛋白A或CD56表达，但也可包括蛋白基因产物9.5、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和Leu7表达［45-46］。另外，笔者团队2021年应用全外显子组测序(WES)技术检测了15例胆囊NEC和22例普通胆囊癌的基因突变和体细胞单核苷酸突变(SNV)［48］。研究发现胆囊NEC中显著突变的基因具有TP53和RB1的驱动作用［48］。3思考与展望胆囊癌治疗的突破需要依赖于新药的开发和基因治疗，而这一点必将依赖于对胆囊癌发病机制的认识和分子生物学研究［49］。笔者团队首次构建胆囊癌微环境单细胞转录图谱，从获得的114927个细胞中鉴定出16种细胞类型，其中上皮细胞、M2巨噬细胞和调节性T淋巴细胞在ErbB通路突变的肿瘤中占优势［36］。另外2019年对157对胆囊癌样本进行全基因外显子组测序，发现ERBB2/ERBB3基因高频突变明显促进胆囊癌细胞的增殖和转移，并与胆囊癌的预后呈正相关，机制研究显示ERBB2/ERBB3基因突变可以通过上调程序性死亡配体-1(PD-L1)表达促进胆囊癌免疫逃逸［50］。针对PD-L1免疫检查点和其他信号分子，已经开展多中心临床II期试验(NCT03768375)，旨在评估晚期或复发性胆囊癌病人不同疗程的疗效［51］。肿瘤微环境和免疫谱在胆囊癌的发生中发挥重要作用，在未来的临床研究中可结合突变谱进行评估［52］。除ERBB2/ERBB3基因，研究还发现SIRT3在大多数胆囊癌病人中表达降低，与高表达SIRT3的病人相比，这些病人表现出较差的总生存期［53］;YAP1靶点AXL在胆囊癌组织中过表达，YAP1和AXL的高表达与较差的预后有显著相关性［42］。随着新技术的应用可更加系统全面地开展胆囊基础研究，但是也带来了不确定性，成本比较高，科研门槛提高等［43］，因此，未来相关研究应趋向