基于色谱毛细管电泳手性分离分析方法文稿

基于色谱和毛细管电泳手基于色谱和毛细管电泳手性分离分析方刘虎威教E-mail:提序言-手提序言-手性分离分析的重要2.手性分离分析方法概述色谱和毛细管电泳手性分离新CE手性分离分析举LC手性分离分析举手性分离分析方法展1.序言-手性的重1.序言-手性的重要自然界中的手性现 自然界中组成蛋白质的种氨基酸除甘氨酸无不对称碳原子外全部是L型；组成和DN中的核糖全部是型。生物分子手性的起源（1）地球上或自然界中某种不对称的驱动力（2） 手性药物分离分析的重 手性药物分离分析的重要“反应停（α-苯酞茂二酰亚）”事件与手性药（别名：沙利度胺、太胺呱啶酮、太谷山亚胺、太咪）(手性药物的质量控制关乎人类的健关于手性的研关于手性的研究现※手性催化与合成（药物、食品等性相互作关键技术性分离与识高效、高灵敏、高通量、实源2.手性分离分析方法概间接方 衍生＊2.手性分离分析方法概间接方 衍生＊＊荧光光电化环糊精及其衍生光活性复合手性选择GCChiralGCChiralEnantioselectivegaschromatographicassayof2-alkylaminesusingN-(trifluoroacetyl)prolylderivativesandachiralcapillarycolumnDavidA.Durden,BruceA.DavisandAlanA.BoultonJournalofChromatographyB;689;165-173(1997)ChemicalstructuresofChemicalstructuresofWhatare2-alkylamines(2-butylamine,2-pentylamine,2-hexylamine,2-heptylamine,2-octylamineandtheirN-methylanalogues)EquipmentandOperationalEquipmentandOperationalParametersforResultandResultandN-(trifluoroacetyl)prolylIsothermalchromatogramsofIsothermalchromatogramsoftheN-(trifluoroacetyl)prolylderivativesof2-alkylamines:(A)=2-butylamine;(B)=2-pentylamine;(C)=2-hexylamine;(D)=2-heptylamineand(E)=2-octylamine.ThemolarquantitiesofthepeakswereintheratioSR-SS-RR-RS=1:2:3:6.IsothermalchromatogramsofIsothermalchromatogramsoftheN-(trifluoroacetyl)prolylderivativesof(A)N-methyl-2-butylaminewithmolarquantitiesofthepeaksapproximatelyintheratioSR-SS-RR-RS=1:1:1:1and(B)N-methyl-2-pentylaminewithmolarquantitiesofthepeaksapproximatelyintheratioSR-SS-RR-RS=2:2:1:1TypicalmassTypicalmass烟草特有亚硝胺类化合物在家兔体内-LC-MS手性转化与手性代谢研NNNNNNNNNNNN烟草特有亚硝胺类化合物在家兔体内-LC-MS手性转化与手性代谢研NNNNNNNNNNNNTSNAs的形TSNAs的形TSNAs的致癌机生成α-ONTSNAs的致癌机生成α-ONN四种存在手性中心的NNNNNNNNiso-为了尽可能充分地对四种TSNAs的手性分离进行优化，我们选择了适正相与反相色谱模式的键合固定羟丙基-β-环状糊精CSP的SINU-四种存在手性中心的NNNNNNNNiso-为了尽可能充分地对四种TSNAs的手性分离进行优化，我们选择了适正相与反相色谱模式的键合固定羟丙基-β-环状糊精CSP的SINU-SPCKM-542手性选择色谱柱（250x4.6mm手性分离条件的优手性分离条件的优色谱流动相组成和缓冲对缓冲溶液浓度和pH分离SINU-PC，SPCKM-542手性选择色谱柱（250Xmmi.d.，5μm）NH3-pHNH3-10pHTEA-TEA-15pH20NH3-pHNH3-10pHTEA-TEA-15pH20pH×25pH15201:320mMTEA-buffer(pH=4.4);2530优化流程-I色谱模VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-N-05n-C6H14+VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-0-20min,10%-90%,0.7002468methanol+20mMTEA-HAc0-20min,10%-90%,0.7优化流程-I色谱模VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-N-05n-C6H14+VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-0-20min,10%-90%,0.7002468methanol+20mMTEA-HAc0-20min,10%-90%,0.7优化流程-II缓冲体系类VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH4-VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-NAT55005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\15-55005AcomparisonbetweenNH4AcandHCOONH420mMbuffer–MeOH3:10.7优化流程-II缓冲体系类VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH4-VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-NAT55005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\15-55005AcomparisonbetweenNH4AcandHCOONH420mMbuffer–MeOH3:10.7优化流程-III流动相比VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-005NAT,20mMTEA-HAcbuffer–MeOH,0.7从上至下10-90B梯度70B45B优化流程-III流动相比VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PRE-005VWD1A,Wavelength=240nm(CHRIAL\PH5-005NAT,20mMTEA-HAcbuffer–MeOH,0.7从上至下10-90B梯度70B45B优化流程-IV缓冲溶液浓度和pH优化流程-IV缓冲溶液浓度和pH优化流程-分离温度的优优化流程-分离温度的优1:3Methanol-20mMNH4Ac-HAcbuffer(pH=4.4)0.7左图:温度对目标物质保留时间的影响（均为前一个峰的保留时间）右图:温度对目标物质手性异构体之间分离度的影响最优条件下四最优条件下四对手性异构体的拆1:3Methanol-20mMNH4Ac-HAcbuffer(pH=4.4),0.7mL/minNNAL,NAT和NNNNNAL,NAT和NNN手性分离后NNONNNNONNNNK的在体内的代谢途径之一是羰基被还原生成NNAL，羰基碳原子原的对称性被破坏，成为一个手性碳。NNAL存在两种不同的光学异构体NNK是TSNAs含量较高，而且致癌性最强的一种，NNAL则是NNK内第一步的代谢产物，与K具有相似的致癌性。因此二者是SNA研究中最受关注的热点。NH3-pHNH3-10pHTEA-15pH20NH3-pHNH3-10pHTEA-15pH20pH×25pH152010mMNH3-buffer(pH=4.2);2530质谱条件和给药方NebGas:质谱条件和给药方NebGas:50Psi,DryGas:10L,Drytemp:Capillary:5000V,Fragmentor:Transitions:NNK,m/z=208.1to122.1,NNAL,m/z=210.2to149.2,NAB(IS),m/z=192.1to162.1DeltaEMV:成年日本雄性长耳大白家兔，体重2.5kg给药：一组为浓度0.1mg/kgNNK标样；一组为浓度0.1mg/kgNNAL标样目标物质NNAL和NNK的分从上至下分别为:NNAL,NNK,NAB的MRM提取离5ng/mL标准加入血浆样品提目标物质NNAL和NNK的分从上至下分别为:NNAL,NNK,NAB的MRM提取离5ng/mL标准加入血浆样品提目标物质的方法学数内标物为ng/mL的NAB，检测限通过衡量ng/mL入提取样品连续五次进样的标准偏差，依照FDA建议的计算公式=s·得到，在N5目标物质的方法学数内标物为ng/mL的NAB，检测限通过衡量ng/mL入提取样品连续五次进样的标准偏差，依照FDA建议的计算公式=s·得到，在N5(1-α=(1-α=为同一个ng/mL的血清标准加入提取样品连续测定五次得到方法的回收率为91.8-(1/x2weight)Peakarea(N=y=0.04393x-(-)-y=(+)-y=因为难以取得(-)-NNAL因为难以取得(-)-NNAL和(+)-NNAL标样，工作曲线遵循下列前提到两种手性异构的NNAL在ESI离子源上具有相同水平的离子化能力两者的离子在质谱仪内部有相同的传输、裂解行为和相同水平的响计算得到的(-)-和(+)-型NNAL的浓度和应等于进样的NNAL的总量使用相同的偏重低浓度点权重的方式，我们对型和型的AL得到的工作曲线非常一致的形式，证明了数据处理方法的正确性。在数据处理之初对二者进行归一化处理之后，得到的曲线显示了二者在质谱仪上也确谢，给药浓度0.1mg/kg谢，给药浓度0.1mg/kg静脉给药NNAL后，家兔血浆中NNAL与NNAL浓度静脉给药NNAL后，家兔血浆中NNAL与NNAL浓度N的比例在逐渐下降。从最开始的左右（市售样品浓度比值）逐渐下降到分钟后的以下。L/D曲函数（因为外推到曲函数（因为外推到t0时，得到的血药浓度无穷大）和多项式（不服(-)-sse:1.347；R2:(+)-()NNAL-sse:1.162；R2:c()NNAL20.7000.0019-(-)-NNAL和(+)-NNAL的拟合将时间外推到=0时，相当将时间外推到=0时，相当于给药后，血浆内NNAL的绝对数量c(-)-24.06ng/mL，c(+)-NNAL20.70ng/mL值为1.16，这个模型和实际中两种异构体的比值1.28基本上相在药代动力学测试的有效时间段内，决定曲线走势的是指数函数部分，二者的幂指数上的时间常数项数值也接近，分别为16.00和15.05这种形式的表达式是一级反应的剩余反应物和时间之间函数的标准模型。这意味着二者在血浆内的清除过程都经过反应速率接近的一级反应。有理由设想二者在血浆中的清除经历同一个途径。也就是说，两种NNAL在血浆内的清除很可能不存在手性选择的拟合方程，均包括一个含时的线性项，对比两个方程线性项，分别为3和的0.0019t。两个方程的线性项系数正负几乎相互抵消；这意味着从数学模型的表达式上看，NNL会向(+)-NNAL转化。100time100timeNNK0.1mg/kgconcentrationofL&D-NNAL家兔静脉注射家兔静脉注射mg/kg的NNK血浆提取样品的提取离子从上到下：生成的NNAL，残余的NNK，内标静脉给药NNK后，家兔血浆中产生的(-)-NNAL与NNAL比值随时间的变化静脉给药NNK后，家兔血浆中产生的(-)-NNAL与NNAL比值随时间的变化10min点，体内产生的(-)-构型与(+)-构型的比例为6.04，其后时间延长而降低。可以猜测家兔血浆中NNK的代谢产物是几乎唯一的NNAL，而(+)-NNAL比例逐渐增大来自前文所述的转L/D检测到的AL浓度很低，需要通过定量曲线外推，建立数学模型时会有较大偏差。从以往结果，几种亚硝胺的代谢服从含时的指数形式；而NNL手性异构体之间的构型转化为零级反应。因此，可以猜测AL的血药浓度服从下列数学模型：(-)-dt ctNNKp3检测到的AL浓度很低，需要通过定量曲线外推，建立数学模型时会有较大偏差。从以往结果，几种亚硝胺的代谢服从含时的指数形式；而NNL手性异构体之间的构型转化为零级反应。因此，可以猜测AL的血药浓度服从下列数学模型：(-)-dt ctNNKp3c-- -2()NNAL当t较大时，线性项对代谢消耗部分指数项的影响必须计入，形式dtcNNKp3tp3--- c()NNAL0其中p1、p2、p3均为常数，cNNK为NNK在血浆中的初始浓度q1tq1t(1)其中，q1、q2均为常数NAT与NNN手性异构体的代NNNN手性碳原子，二者都存在手性异构体NAT与NNN手性异构体的代NNNN手性碳原子，二者都存在手性异构体NH3-pHNH3-10pHTEA-15pH20NH3-pHNH3-10pHTEA-15pH20pH×25pH152020mMNH3-buffer(pH=4.0);2530质谱条件和给质谱条件和给药方NebGas:50Psi,DryGas:10L,Drytemp:Capillary:5000V,Fragmentor:Transitions:NNN,m/z=178.1to148.1,NAT,m/z=190.2to160.1,NAB(IS),m/z=192.1to162.1DeltaEMV:成年日本雄性长耳大白家兔，体重2.5kg给药：浓度分别为0.1mg/kgNNN和NAT目标物质NAT和NNN的异构体分从上至目标物质NAT和NNN的异构体分从上至下分别为:内标NNN的MRM提取离子5ng/mL标准加入血浆样品提目标物质的方法学数内标物为ng/mL的NAB，检测限通过衡量ng/mL入提取样品连续五次进样的标准偏差，依照FDA建议的计算公式=s·得到，在N5(1-α=(1-α=为同一个样品连续测定五次得目标物质的方法学数内标物为ng/mL的NAB，检测限通过衡量ng/mL入提取样品连续五次进样的标准偏差，依照FDA建议的计算公式=s·得到，在N5(1-α=(1-α=为同一个样品连续测定五次得到方法的回收率为94.2-LinearLinearregression(1/x2(N=Peakarea(-)-y=(+)-y=(-)-y=(+)-y=类似于前述对NNAL的类似于前述对NNAL的讨论，认为两种手性异构的TSNAs有相同离子能力，相同的传输和裂解和响应；两个异构体浓度之和应等于进样浓度使用相同的偏重低浓度点权重的方式，我们对(-)-型和(+)-型的NN和T得到的工作曲线，其形式也非常一致。在数据处理之初对二者进行归一化处理之后，我们得到的曲线显示了二者在质谱仪上也确实产生相同的响应给药浓度0.1给药浓度0.1mg/kg10time10time静脉注射NNN后，手性异构的NNN在家兔体静脉注射NNN后，手性异构的NNN在家兔体内的代，concentration静脉给药NNN后，家兔血浆中NNN与NNN浓concentration静脉给药NNN后，家兔血浆中NNN与NNN浓concentration(-)-(-)-c()NNAL8.74213.936e--c()(-)-(-)-c()NNAL8.74213.936e--c()NATsse:0.038；R2:sse:0.515；R2:(+)-(+)-17.214e-c13.180-()NNALsse:0.194；R2:sse:0.153；R2:(-)-NAT和(+)-NAT的拟合代谢曲(-)-NNN和(+)-NNN的拟合代谢将时间外推到t0，有c(-)-NAT13.9将时间外推到t0，有c(-)-NAT13.9c(+)-13.2ng/mL，二者的比值为1.05从混合标样谱图中得到的1.01:1的比例接近；有8.7ng/mL，c(+)-NNN=17.2ng/mL)-者的比值为0.510.的比例接近；数学模型在这一点上的表现令人满意。项数值也接近，分别为和以及和。每一对手性异构体代谢速率也和在研究中观察到的一样是几乎等同的。得到的数学模型与实际情得到的数学模型与实际情况基本吻合，外推到t0时的结果与每种TSN的一对手性异构体清除过程的主反应都属于一级反应，而且二者的反应速率也非常接近。有理由认为游离的TSNA在血浆中的清除的主反应是不具有手性选择性的。观测到了(-)-NNAL到(+)-NNAL的转化过程在家兔体内，K向AL的代谢过程中，反应几乎是手性专一的生成的NAL比例远高于AL。有报导指出NAL是更加倾向于发生-羟基化反应，并进一步与生物大分子加合的一种异构体3.色谱和毛细管电3.色谱和毛细管电泳手性分离新CE的强项—手性分离与基因测序CEvsGCvs毛细管电泳毛细管电泳手性分离分析手性分离应手性分离应用EnantioseparationofEnantioseparationofzolmitriptanbyCD-iso-Internaliso-InternalDAD1C,Sig=254,16Ref=off8642DAD1C,Sig=254,16Ref=off8642DAD1C,Sig=254,1DAD1C,Sig=254,16Ref=350,100(LCC\11090008.DmANANNAiso-NNA25NANN2015NN105012141618mCE和CE-MSRSD(%)ofmigrationRSD(%)ofpeakCZECZESCZECZESCE和CE-MSRSD(%)ofmigrationRSD(%)ofpeakCZECZESCZECZESiso-LCE和CE-MSRegressionequation(log-5.0-y=1.28