【Syx】PCR(聚合酶链式反应)课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序分为哪四个步骤？2.什么叫目的基因？获得目的基因的方法有哪些？13.构建基因表达载体的目的是什么？14.构建好的基因表达载体主要由哪些部分组成？每个部分作用是什么？构建基因表达载体的过程是怎样的？15.启动子和起始密码子、终止子和终止密码子区别？17.把目的基因导入植物细胞、动物细胞和大肠杆菌的方法分别是？18.农杆菌转化法适合把目的基因导入什么样的植物细胞？19.为什么要把目的基因插入农杆菌的T-DNA？20.把目的基因导入大肠杆菌为什么要先用Ca2+处理大肠杆菌？21.怎样检测目的基因是否导入受体细胞？是否转录出mRNA和翻译出蛋白质？22.如何从个体水平检测植物是否出现了抗病（虫）特性？3.PCR的具体含义是什么？使用到的仪器叫什么？4.PCR扩增DNA的条件有哪些？5.PCR的每个循环可以分为哪三步？每一步的温度大致为多少？每一步的具体含义是什么？6.PCR时,引物与模板链的哪一侧配对？7.子链的合成方向？脱氧核苷酸加在引物的哪一端？8.在DNA聚合酶的作用下，两个引物之间的DNA序列以什么形式扩增？9.一个DNA复制n次需要引物多少种多少个？10.一个DNA复制n次总共可形成多少个DNA？其中含有引物的DNA有多少个？只含目的基因片段（不含黏性末端）的DNA有多少个？11.一个DNA复制第n次需要多少种引物？多少个引物？12.常用什么方法鉴定PCR的产物？DNA片段的扩增及电泳鉴定1.PCR扩增DNA的原理是什么？2.电泳鉴定DNA的原理是什么？3.PCR扩增DNA时，微量离心管中要加入哪些成分？4.凝胶中DNA分子的迁移速率与什么有关？5.PCR每个循环程序要经历哪三步？温度、时间？6.接通电源后，DNA向阴极还是向阳极移动?

7.凝胶中留一个加样孔加标准参照物的目的是什么？8.PCR所得DNA电泳后出现位置不同的几条带，原因可能是什么？第三章基因工程第2节基因工程的基本操作程序PCR

(1)概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1.DNA复制的条件？2.什么是引物？为什么要用引物？引物的作用是什么？1.PCR(聚合酶链式反应)模板：

原料：

能量：

酶：

DNA的两条母链。4种脱氧核糖核苷酸。ATP解旋酶、DNA聚合酶引物作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA。(2)PCR的条件:①DNA（含目的基因）模板；②分别与模板DNA相结合的两种引物；③A、T、G、C四种脱氧核苷酸；④耐高温的DNA聚合酶；⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）；⑥能严格控制温度的温控设备。耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶（3）扩增过程：3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性90℃以上，双链DNA解聚为单链B.复性50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合C.延伸72℃左右，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’琼脂糖凝胶电泳（4）产物鉴定：扩增次数第1次第2次第3次第n次DNA分子数含引物A(或B)的DNA分子数同时含引物A、B的DNA分子数共消耗的引物数量22046814262n2n+1-22n-21372n-1利用PCR技术获取目的基因，请画出扩增2次的结果？思考：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（等长的DNA片段）？思考：1个DNA循环n次后产生目的基因多少个？2n-2n通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图是获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中在目的基因两端的引物中分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述错误的是A．限制酶a和限制酶b的识别序列应分别增加至引物1和引物2的5'端B．通过两种限制酶将扩增出的含突变位点的目的基因切割下来有利于其定向插入载体C．第3轮PCR结束后，两条链完全等长的且含有突变碱基对的DNA分子有1个D．在第3轮PCR结束后，同时含引物1和引物2的DNA占3/4实验探究：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.PCR扩增DNA的原理是什么？2.电泳鉴定DNA的原理是什么？3.凝胶中DNA分子的迁移速率与什么有关？4.凝胶中DNA如何检测？5.凝胶中留一个加样孔加标准参照物的目的是什么？加入指示分子大小的标准参照物6.PCR所得DNA电泳后出现位置不同的几条带，原因可能是什么？如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。PCR引物设计原则

两种引物是对向的，目的基因在中间；两种引物都结合在DNA模板链的_____端，子链延伸时沿着引物向

端延伸；引物自身不应存在互补序列两条引物之间不应存在互补序列引物越长，G+C比例越高，退火温度越高引物的长度一般在18~25b（base碱基），太短则特异性不够强，太长则退火温度会比较高。两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。⑥需在两种引物的5’端加上启动子（或终止子）序列和限制酶的酶识别序列3’3’1.在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操作有哪？提示(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。(3)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。拓展

提升科学思维2.如何来评价扩增的效果？提示观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。DD367(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？提示两种引物之间不能互补配对。(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。CD（6）n轮：(2n＋1－2)个，第n轮：2n个。PCR方法步骤用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液离心扩增根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。电泳方法步骤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳、观察接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。利用