《肿瘤动物模型》课件

肿瘤动物模型耿飞郑雅元2015342056导师孔维肿瘤动物模型一.自发性肿瘤动物模型二.诱发性肿瘤动物模型三.移植性肿瘤动物模型及其研究方法四.人体肿瘤异种移植性肿瘤模型一、自发性肿瘤动物模型定义：实验动物不经人为实验处理而自然发生的肿瘤，成为自发性肿瘤实验动物选择：高发病率的实验动物一般选用小鼠（mouse）常用肿瘤模型小鼠肿瘤自然发生率自发性肿瘤动物模型的优点自然发生，肿瘤发生学与细胞学特点与人类肿瘤相似。2.便于慢性治疗及综合治疗。3.发生条件自然，可通过细致观察研究发现新的环境致癌因素及其他致癌因素；可以着重观察遗传因素在肿瘤发生中的作用。自发性肿瘤动物模型的缺点肿瘤发生情况参差不齐。难以短时间内获得大量肿瘤材料，耗时长，耗资大。发生肿瘤的动物肿瘤生长速度差异大，难以评价。二、诱发性肿瘤动物模型定义：使用致癌因素(Carcinogens)在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型。原理：利用外源性致癌因素引起细胞遗传特性异常而呈现出异常生长和高增殖活性，形成肿瘤。用于诱发实验性肿瘤的动物种类很多，以啮齿动物的使用最多、应用最广，包括各种大鼠、小鼠、豚鼠等诱发性肿瘤模型动物选择诱发性肿瘤动物模型建立方法原位诱发致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤。异位诱发将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而产生的该组织或器官的肿瘤。诱发性肿瘤动物模型建立方法致癌物致癌物1.涂抹法（皮肤癌）2.经口给药法（消化道或消化腺)3.注射法4.气管灌注法（肺癌）5.穿线法6.埋藏法诱发性肿瘤模型——致癌物给予途径诱发性肿瘤模型——举例[特点]：①DEN总量达868mg，观察时间为100天，发癌率可达40％，DEN总量达1176mg，观察时间为半年时，发癌率可达94％，其中支气管鳞状细胞癌占41％。②乌拉坦注后3个月肺腺癌发生率为100％，且多数为多发性，诱发肺肿瘤的部位和组织分型与人类肺肿瘤相近似。[特点及应用]：DEN诱发大鼠致癌率为70％．DBA诱癌率为60％，黄曲霉素诱发大鼠肝癌发生率为80％，此种方法从病因学角度分析，与人体肿瘤较为近似，故此类模型常用于肿瘤特点的深入研究。三.移植性肿瘤动物模型及其研究方法定义：模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或异种动物体内连续传代而形成移植性肿瘤动物的肿瘤实验动物选择：移植性肿瘤常用动物为小鼠、大鼠和地鼠肿瘤细胞的选择：筛选抗癌药物时，最好选用3类瘤株，及肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，小鼠Lewis肺癌、小鼠黑色素瘤B16及小鼠白血病P388是目前最受重视和应用最广的。接种方法（无菌操作）1.实体瘤

制备瘤块冻存的瘤株

瘤源动物

7~10d

增殖获得瘤块移入宿主体内给动物接种受体动物实体瘤接种法：瘤块接种法、瘤细胞悬液接种法、培养细胞接种法、活细胞接种方法等

瘤块接种法选取接种后7~10d生长状态良好的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。切开皮肤，剥离出接种用的瘤块，剔除非肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、淡红色（黑色素瘤则呈黑色或黑紫色）、鱼肉装的瘤组织，在无菌平皿内剪成2mm3小块。平皿放置在冰块上，平皿内放置少许灭菌的PBS或其它营养液。用无菌套管针抽吸瘤块，接种于同种受体动物腋窝皮下（接种部位皮肤应先消毒）。也可取出肿瘤后切成小块，在受体动物的腋下剪开一个小口，用无齿眼科镊夹取瘤块，送入切口内。腋窝部皮肤松弛，能允许肿瘤生长的较大，宿主动物的寿命也可延长。接种操作的时间尽可能缩短，从瘤块取材到接种结束一般应在30min内完成。

瘤细胞悬液接种法每次接种的动物数量较多时可采用此法。具体方法是：无菌操作取出瘤块，将数个瘤块混合后剪成小块，放入玻璃匀浆器中，加无菌生理盐水向一个方向转动研磨后，经滤网过滤，加生理盐水稀释成1:3~1:4（肿瘤g：生理盐水ml）的瘤细胞悬液，用台盼兰染色法计数活细胞数，用1ml注射器注射到接种部位，每个接种点接种0.2ml(一般含1×106~1×107个细胞数）。通常接种到腋窝皮下，每只动物可选用多个接种点。

瘤细胞悬液接种法将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化脱壁后，用PBS或者生理盐水以1000r/min离心10min，洗涤2次，洗掉细胞中胰蛋白酶和培养液中血清等成分，用台盼蓝拒染法计数活细胞数，用生理盐水将肿瘤稀释成一定浓度的细胞悬液，细胞悬液置于冰上，使用1ml注射器在每个接种点接种0.2ml(含1×106~1×107个细胞),应尽快注射到接种部位。2.腹水瘤肿瘤细胞的冻存与复苏对肿瘤细胞或瘤株进行冷冻保存可以使其得以长期使用，防止退化或变异，保存不同代细胞的特征。一般在液氮中保存1~2年，细胞存活率可达80%~90%。1.冻存方法：取对数生长期增殖旺盛的细胞，胰蛋白酶消化、离心、洗涤，用含7份培养液、2份小牛血清、1份DMSO配成（1~5）*106个/ml的细胞悬液，转入细胞冻存管。将冻存管于4℃放置30min,-20℃放置4h，-70℃过夜，然后放入液氮中。2.复苏方法：取出冻存管，迅速放入38~40℃水浴中，并不停摇动使其在一分内全部融化，500~800r/min离心5min,弃上清，加入培养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，以后按常规培养。四.人体肿瘤异种移植性肿瘤模型这种模型使用人的肿瘤细胞，在病理组织形态和遗传特征等方面均与人类肿瘤相同，用这种模型可以比较直接的研究人类肿瘤的生物学特性及抗肿瘤药物。常用的宿主动物：裸小鼠和C57BL/6小鼠裸小鼠作为移植宿主实验动物：在SPF屏障系统内繁殖生长的BALB/c裸小鼠，6~8周龄，体重21~22g。瘤源：来源大致分两类，一类是人的肿瘤细胞株，另一类是源于人体肿瘤组织快的癌细胞。常用的人癌裸鼠细胞株、接种方法和最佳生长期为:结肠癌HCT-8（匀浆，3周）、胃癌MGC-803(组织块，4~5周）、肝癌BEL-7402(组织块，4周）、小细胞肺癌LTEP-SM1(组织块，4~5周）、乳腺癌MCF-7(组织块，4~5周）等操作方法（例：人胃腺癌SGC-7901)：1.超净台内将移植瘤剪成2~3mm3大小的瘤块，用套管针接种在BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下2.接种24h后随机分组，开始给予受试药进行实验治疗，试验周期6周左右3.停药次日，称体重，剥取肿瘤并称重，计算瘤重抑制率。观察指标与疗效评价：1.动物在接种肿瘤后6周左右形成1g以上的瘤块（平均瘤重），则表明移植肿瘤成功2.如出现20%小鼠的瘤重小于400mg，则表示肿瘤生长不良3.在药物治疗期间，如给药组小鼠死亡率超过20%或剥取肿瘤后平均体重下降超过15%（自身对照），表示药物存在毒性，应当减量重新实验4.药效可根据给药后瘤重抑制率来评价，瘤重抑制率大于30%，并经统计学处理组间差异具有统计学意义时，表示该受试药有苗头。重复3次，如疗效稳定，评定该药有一定疗效注：肿瘤模型形成时间较长，需30~40d甚至更长。在异种移植瘤实验中，还有一种正位移植，即将人癌组织或细胞按其在人体内的原发部位，接种于相应的器官，有别于通常的皮下接种（异位接种）免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主实验动物：体重120~160g的Wistar大鼠操作方法（例：人胃癌细胞株）：1.大鼠分笼饲养，皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200mg/kg体重，2d后用10Gy(1000rad)60Co全身照射，照射后的大鼠饲养于洁净环境中，每日紫外线灯照射1h，自由摄食饮水，饮水中加土霉素1