菌种保存方法及菌种的复苏传代及保存标准程序

菌种保存方法

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

一.保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

二.常用的器材

所要保存的微生物；

肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点

1．斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

2．液体石蜡保藏法

（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。

（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3．滤纸保藏法

（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。

（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

4．沙土保藏法

（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

（9）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。

（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。

5．液氮冷冻保藏法

（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。

（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。

（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

6．冷冻干燥保藏法

（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。

（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。

（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。

（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。

（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．菌种的保存为了有效的保存菌种，必须掌握每种细菌的生长发育规律及生物学特性，外界物理因素对代谢、生长的影响，定期检查，定期移种，详细记录，专人保管。保存菌种的基本原理是：降低代谢速度以延长其生命。因此，主要采取降低细菌生活环境的温度，使其处于不繁殖，但不致于死亡，仍维持生命的状态；隔绝空气降低代谢过程；冰干脱水，停止生命活动保持生命力。一、短期保存方法1．继代培养传统的菌株保存方法是每隔一段时间便将菌种植入新鲜的培养基中重新活化，间隔时间的长短依微生物、培养基种类及外在环境的不同而有所差异，有些菌种必须每天重新接种做继代培养，有些菌种则数周或数月再重新接种一次便足够。以此种方式保存菌株时，必须考虑三个条件：(1)适合保存的培养基；(2)理想的保存温度；(3)重新接种活化的频率。常用的保存培养基仅含有最基本的养分，因为微生物在这种培养基中的代谢速度缓慢，可延长重新接种的间隔时间；但是有些菌种因为需要特殊的化合物才能表现出特定的生理现象，所以必须接种于复合性培养基中，若该菌种生长较迅速或有代谢产物累积的情形，则应增加重新接种的次数。最简单的保存方法是于室温下以试管保存，通常这些试管是放在试管架上或是具有试管座的特制盒中，然而以此种方法保存菌种常有因水分散失而造成菌脱水的问题，除非实验室中有空调设备，可以维持温度的稳定。若使用具有橡胶垫片的螺旋盖，并以蜡纸于螺旋盖处封口，放入塑料盒中，储存于5--8℃此种保存方法主要的缺点是：(1)菌株易遭受污染；(2)菌株易有编号错误、保存位置与编号不符或卷标贴错，以致菌株遗失的情形；(3)可能挑取到突变菌株；(4)不易取得保存的空间。2．矿物油浸泡保存利用无菌的矿物油保存菌种是既简单又便宜的方法，且其保存期限可长达数月或数年，但使用这个方法时，常因矿物油灭菌不完全而使菌种遭受污染。最好的矿物油灭菌方法是以烤箱在170℃下加热1--2h，而非以灭菌锅灭菌。以矿物油保存菌种的步骤为先以斜面、平板或液态培养基培养菌株，待菌株长到适当生长期后，加入已灭菌的矿物油，然后保存于4℃，矿物油的液面必须盖过培养基顶端约2cm(若是斜面培养基，则必须全部覆盖)3．一般冷冻保存菌种可贮存在-20--0℃之间，菌的存活率则依菌的种类而定，一般而言，应尽量避免使用这种方式，因为冷冻会对菌种造成伤害，然而有些菌可以用此种方法保存6个月至2年。二、长期保存方法1．超低温冷冻保存此种方法主要将菌种保存于超低温的冷冻柜中，其程序如下：（1）准备工作将甘油及蒸馏水以1:4的比例混合，配制成100mL或少于100mL的甘油溶液，于灭菌锅中以120℃,20min灭菌备用。取小量的甘油溶液，分装于保存菌种用的小瓶子中，勿大量装在一起，否则反复冷冻、解冻及接种的过程，均会增加污染或菌株死亡的机会，每次以小量分装，且准备多重复，可以减少前述的缺点。（2）培养及分装过程以准备好的的甘油溶液制备孢子、菌丝或细胞的悬浮液后，分装于容积为2mL的小塑料瓶中，每瓶各加入1mL的悬浮液，若须盛装较大体积的悬浮液时，亦可选择较大的容器；分装后贮存于-50℃的冷冻柜中，如果菌株已先生长于固体培养基上，也可以将其浸泡于20%(v/v)的甘油溶液中，再贮存于冷冻柜。（3）贮存将各个小瓶子做好登记及编号，依序置于具有区隔装置的贮存盒中，贮存盒外亦须登记及注明盒内贮存瓶的编号，以便日后能迅速查询；贮存盒的材质可为塑料或腊质包膜等具有防水功能(如：Nalgene)之冷冻盒。（4）重新活化自冷冻库中取出菌种贮存瓶，置于室温使其解冻，或是以37℃水浴迅速解冻，解冻完成后立即取出瓶子，以70%酒精擦拭消毒，再以无菌操作方式打开瓶盖，取出菌液接种至新鲜的培养液中重新活化。2．冷冻干燥保存法此方法是将冷冻菌种于减压下利用升华去除水份，使菌种保存于无氧、湿气、光的条件下，有些菌种可保存长达30年之久。其操作方法为使用约10毫升的小瓶子，配制20﹪脱脂奶粉或24﹪蔗糖溶液作为保护剂，加上等量的生长培养基，收集菌数浓度约108cells/mL之对数生长期末期或静止期前期之菌体，将菌体悬浮于保护剂及生长培养基中，细菌悬浮液预冷于丙酮或干冰中，使其于减压前冷冻成固体，再将真空度降低至30um汞柱，抽干18h，熔封后贮存于5℃菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。1.1.1①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃1.1.2.7取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。1.2为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-801.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。1.3冻存菌悬液的复苏：1.3.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。1.3.2操作：1.3.2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。1.3.2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。1.3.2.3用75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。1.3.2.4点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至10ml液体培养基中（生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中）。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。1.3.2.5将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。1.3.2.6将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在30~35℃恒温培养18-24小时，真菌在23~28℃恒温培养24-48小时，1.3.2.7仔细观察培养物：如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置2~8℃1.3.2.8注意：已解冻的冻存管不可再冻存。2.菌种的接种、传代2.1.准备①用具：接种环、酒精灯。②培养基：营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。④菌种：根据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超过4代。2.2将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。2.3点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，两试管口平齐靠近火焰旁。2.4用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。2.5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。2.6将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。2.7取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。2.8已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；真菌管一般置23~282.9培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。2.10检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃2.11菌种（第n 代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。注意：黑曲霉*致病性很强，操作时应特别注意：①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操作的风险性。②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。③若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。④接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。⑤接种传代后，使用过的器具均需在121℃，30分钟高压灭菌后再作处理。3.菌种的保存：3.1菌悬液冻存法：冻干菌种（0代）复苏后，可按上述方法制备第1代菌悬液、第2代菌悬液进行冻存。3.2琼脂斜面低温保存法：日常使用的工作用菌种可用此法在短期内保存。3.2.1将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔3.2.2适用范围：细菌、酵母菌、真菌保藏。3.2.3各类菌种保藏条件及时间：菌种培养基保存温度传种时间细菌一般多用营养琼脂或根据菌种规定选用培养基4~6芽孢杆菌3~6个月其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6一般4~6个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等。4~6每4个月移植一次（每2个月移植一次）3.2.4注意事项：①保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。②保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。③必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。④每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保存。3.3液体石蜡保存法：利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。

3.3.1方法：3.3.1.1将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。3.3.1.2取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃3.3.1.3将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃3.3.2适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。3.3.3注意事项：①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1㎝为宜。⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。4.菌种在传代、保存或使用过程中发现污染、变异，应及时销毁，不得用于常规检验。5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录：《0代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。6.菌种按“检定菌管理制度”管理。7.附录：7.1菌种编号：传代复苏的菌种应有统一编号,编号方法为:菌种代号-G或W-代次-管号。G表示用于冻存的菌种，W表示工作用菌种。□□-□□□□-□-□（□）注：①②③④⑤①菌种代号：常用菌种的代号见下表：菌种名称代号菌种名称代号菌种名称代号金黄色葡萄球菌JP生孢梭菌SB大肠埃希菌DC铜绿假单孢杆菌TL白色念珠菌BN短小芽孢杆菌DX枯草芽孢杆菌KC黑曲霉HQ藤黄微球菌TH②菌种购进的年、月：如0608表示2006年8月购进③菌种代次，用1、2、3、4、5表示。④母代冻存菌种的编号，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…表示。⑤菌种的序号，用1、2、3…表示。7.2常用工作用菌种的生物学特征①金黄色葡萄球菌形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄状，菌落直径为0.8～1.5mm，革兰氏染色阳性。培养特性：⑴在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中，生长良好。在28～38℃生长较好，pH为4.5～9.8，以pH7.4左右最好。⑵营养琼脂平板，培养24～48小时，形成圆形凸出、边缘整齐、表面光泽且金黄色的菌落，直径1～2mm（应挑选光滑型菌落）。⑶营养肉汤培养基，生长迅速，经37℃24小时培养呈均匀混浊，管底稍有沉淀，微微振摇即可上升，消散均匀。但培养基含有可发酵糖类或菌型变为粗糙型者，可出现自然凝集现象，⑷抵抗力：在干燥情况下，可生存数月，在无糖培养基内生存数年。对热80℃30分钟才被杀死。在1%石炭酸液中15分钟被杀死，碘酒中须1分钟，75%酒精中须数十分钟才被杀死。②藤黄微球菌形态与染色：个体略大于葡萄球菌，直径0.5～3.5um，单个成双或四联状排列，或呈不规则的团块。革兰氏染色呈阳性。培养特性：专性需氧菌，营养要求不高，最适温度为