第七章 核酸提取与鉴定

第七章核酸提取与鉴定1

核酸的提取与鉴定第一节预处理

第二节DNA的提取

第三节RNA的提取

第四节核酸的鉴定概述

研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA过程：

裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中

纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等一、概述

总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、分子量、测序（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）1、植物样品

新鲜组织先用无菌生理盐水洗；干药材除去霉点，无菌水浸洗；（一）样品预处理（获取分散细胞）

捣碎或剪碎；加液氮研磨成粉状。2、动物样品（1）组织样品：新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70℃/液氮低温保存）；甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。（2）血细胞样品：（3）培养细胞：

离心，弃细胞培养液；用缓冲液多次漂洗；来源：新鲜血液或者冻贮血液；抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸钠），不可使用肝素；分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）3、微生物培养物样品离心获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速离心获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。（二）提取用具预处理1、DNA提取用具的处理要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。2、RNA提取用具的处理要求无菌，防止二次污染。

RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。二、真核生物基因组DNA的常规提取裂解细胞，溶出DNA除去杂质重新溶解DNA沉淀、浓缩DNA

⒈破碎细胞，溶解DNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等植物样品提取液：含CTAB核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），螯合这些离子。2、除去杂质（主要是蛋白质）

（SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）——苯酚抽提蛋白质——氯仿抽提、萃取苯酚经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。蛋白质苯酚氯仿核酸溶液3.沉淀DNA有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）再用75%乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA将DNA溶于水或TE溶液。

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA－CTAB法

SDS法原理基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。DNA提取的一般流程三、质粒DNA的提取质粒DNA特点：（1）细菌基因组DNA以外的小型闭合环状双链DNA分子。（2）大都含有抗生素抗性基因。（3）可自我复制或表达。（重组DNA技术中构建载体）（4）大小1-300kb。1、培养细菌和扩增质粒加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。

2、收获细菌和溶菌离心收集细菌细胞。细菌裂解方法：机械法化学试剂法（SDS）溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）3、分离质粒DNA基因组DNA与质粒DNA分离碱裂解法（最常用）用溶液1（EDTA）悬浮菌体。溶液2（NaOH和SDS）裂解菌体，蛋白质与DNA发生变性。溶液3中和pH，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，基因组DNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。离心后，质粒DNA留在上清液中。通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。降低温度，质粒DNA复性留于上清液，基因组DNA复性很慢与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。煮沸裂解法（偶尔用）梯度离心法（极少用）基因组DNA断裂，吸附大量EB，密度大；质粒DNA密度小。利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNA和质粒DNA。离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。4、质粒DNA的纯化蛋白质苯酚氯仿核酸溶液四、RNA的提取（一）总RNA的提取所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

——最关键的是抑制RNA酶的活性。常用的RNA酶抑制剂

焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。异硫氰酸胍：可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。

所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。

（2）RNA提取中RNase污染的控制

RNA的提取方法

1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性；再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞染色体DNA。2、盐酸胍-有机溶剂法利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；3、氯化锂-尿素法利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶；氯化锂选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。4、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离；用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。

5、试剂盒快速提取法裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性；氯仿等抽提去除蛋白质和DNA；乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA；此法操作简便快速。

Trizol一步提取总RNA：TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌处理）配制的75%乙醇4℃预冷；步骤：2）1mlTrizol匀浆好的样品；3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋白变性4）室温，静置3分钟；5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）6）取上清0.5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）放入另一个1.5ml的EP管中；7）加入等体积的异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟10）弃上液(移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触到沉淀斑区）11)沿试管内壁轻轻加入1ml4℃预冷的75%乙醇,注意切勿冲击到沉淀斑区12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用真空干燥5分钟）14）加入50μlDEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加DEPC处理水）15）-80℃冰箱保存。组织匀浆

（二）mRNA的提取从总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）层析柱。mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱mRNA。（一）核酸浓度检测OD260＝1时（比色皿厚度1.0cm）双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA(μg/ml)=OD260×50RNA（μg/ml）=OD260×40五、核酸的鉴定（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）核酸在260nm处有吸收峰，蛋白质在280nm有吸收峰核酸的纯度用OD260/OD280比值表示。

DNA样品：OD260/OD280

＝1.8，DNA纯度高OD260/OD280>1.8，含RNA，或DNA部分降解OD260/OD280<1.8，含苯酚或蛋白杂质RNA样品：

OD260/OD280

＝1.8~2.0—RNA纯度高<1.8，含蛋白杂质；>2.0，RNA出现降解（三）核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带，其中28srRNA的亮度应为18srRNA的两倍，5srRNA

较弱。电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。根据电泳支持介质分为琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.1~60kb）聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段（50~1000bp）六、电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。琼脂糖浓度(％)线型DNA分子的分离范围(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.