脓毒症病理生理机制研究新动态

脓毒症病理生理机制研究新动态

国家973课题和国家杰出青年基金工程研究背景脓毒症(Sepsis)是严重创(烧、战)伤、休克、感染、外科大手术患者常见的并发症，进一步开展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，是临床危重患者的最主要死亡原因之一。脓毒症和MODS来势凶猛、病情进展迅速、预后险恶，给临床救治工作带来极大困难，已成为现代危重病医学面临的突出难题。研究背景尽管脓毒症新概念与临床特征的认识有所进步，但严重脓毒症、MODS的临床试验性治疗相继失败，其病死率仍居高不下(50~80%)。究其原因，关键是有关脓毒症和MODS的根本发病环节及作用机制尚未充分说明，缺乏早期有效的预防与治疗措施。因此，开展其研究具有极其重要的理论意义和实用价值。脓毒症根底研究进展遗传背景(基因多态性研究)重要诱发因素(微生物及其产物、内/外毒素作用)晚期炎性介质与效应分子(高迁移率族蛋白-1)细胞内信号转导机制(MAPK通路,JAK/STAT通路)网络效应与器官间相互作用(神经-内分泌-免疫凝血-纤溶-炎症)调节方法与干预途径(活化蛋白C)严重损伤后全身性炎症反响失控及器官损害受体内众多基因的调控，但为何有的人群易于并发脓毒症和MODS？对MODS患者采取相似的治疗方案，但机体反响和预后可能完全不同。这些现象是否与体内存在某种MODS相关的“易感基因〞或基因表达特性的改变影响宿主对应激状态的敏感有关？基因多态性TNF-2纯合子患者TNF-水平和病死率均高于杂合子或TNF-1纯合子患者，证实TNF-2基因型可能是严重脓毒症患者出现高TNF-水平和不良预后的基因标志之一。TNF-双等位基因Nco1多态性与严重脓毒症和器官损害的发生密切相关,分析其多态性有助于评估并发脓毒症和MODS的易感性及明确对抗TNF免疫治疗的反响性。基因多态性(基因组序列上的变异)是决定人体对应激打击易感性与耐受性、临床表型多样性及药物治疗反响差异性的重要因素。基因多态性

基因大规模直接测序，明确了中国人群中一些在创、烧伤感染发病中起关键作用的效应分子的基因多态性分布，并初步进行了临床关联分析和功能研究。

已明确TLR4受体5’区-1892G→A、-1837A→G、CD14启动子区-1145G/A和-159C/T、IL-1β启动子区-1470G→C、-511T→C和-31C→T与创伤感染易感性存在密切的内在联系。

CD14C-159T基因多态性对TNF-αmRNA表达的影响8携带不同CD14基因多态性烧伤患者单核细胞外表HLA-DR的表达*

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烧伤脓毒症患者预后与单核细胞

HLA-DR结合量的关系**

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CD14C-159T基因多态性与MODS发生率及死亡率的关系基因型例数（n）MODS例数（n）死亡例数（n）-159CC700-159CT1064-159TT4331171例特重度烧伤患者基因型与脓毒症及死亡率的关系

基因型例数非脓毒症（例）脓毒症（例）死亡率（%）CC73（42.9）4（57.1）2（28.6）TC4618（39.1）28（60.9）11（23.9）*TT185（27.8）13（72.2）9（50.0）

临床试验性治疗脓毒症的实践中，应当考虑基因的因素。如果对照和治疗组CD14C-159T或其他易感基因多态性的分布频率不一致，那么结果无论是支持或是否认试验性治疗，其判定很可能会产生偏差。脓毒症早期识别与判定预后的辅助工具。在不久的将来，基因多态性的检测很可能会帮助患者选择个体化的有针对性的治疗，从而有利于降低脓毒症和/或MODS的发病率。13外毒素研究背景诸多研究证实，细菌、内毒素、病毒及寄生虫感染等在机体的脓毒性反响中均可起触发剂作用,其中革兰阴性菌及其内毒素在脓毒症发病中的作用与机制已进行了较为广泛、深入的研究。然而，长期以来，人们对于革兰阳性菌及其外毒素的致病意义认识缺乏。临床资料说明,革兰阳性菌脓毒症的发病率逐年上升，至二十世纪90年代末已达脓毒症发病率的50％以上，并仍有升高趋势。其中金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)发病率位居首位，是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭的重要病原菌。

金葡菌主要致病因子外毒素(肠毒素、TSST-1、溶血素)酶(血浆凝固酶、透明质酸酶、溶脂酶)细胞抗原(荚膜抗原、细胞壁成分、A蛋白)细菌学研究说明，可溶性外毒素的产生是G＋菌感染的重要标志之一，在G＋菌感染性疾病的发生、开展中具有重要意义。其中金葡菌肠毒素因其“超抗原〞特性以及在中毒性休克综合征发病中的特殊意义而倍受关注。T细胞抗原呈递细胞T细胞抗原受体MHCII分子T细胞抗原呈递细胞普通抗原超抗原TCRV

区ng/ml

金葡菌及其外毒素的分布、产毒率与意义

创面别离病原菌1880株，金葡菌别离率从1995年的17.7%(第3位)上升为1999年的29.3%(居第1位)、2003年44.4%。278例次静脉内置管的严重烧伤病人，7例次发生导管脓毒症(5例死亡)，其别离病原菌中金葡菌占50%以上。烧伤患者别离127株金葡菌产毒率达91.6%，以同时产生多种类型毒素者居多[同时产肠毒素B、C者最为常见]，其中90%以上为耐药菌株。检测100株金葡菌肠毒素产生情况，其中60株MRSA全部产一种以上肠毒素，而40株非MRSA产毒率仅为20%。肾脏蓄积排泄肾组织中SEB含量明显高于其它脏器。SEB可经肾小球自由滤过，并被近端小管细胞完全重吸收。肾动脉结扎和肾切除均可导致体内肠毒素的去除延迟，增强其对动物的致死能力。给家兔静脉注射125I标记肠毒素,循环中肠毒素迅速去除，并分布到肝、肾、肺、脾等组织，其中肾脏含量最高。

肾脏是肠毒素蓄积和排泄的最重要场所之一。烫伤脓毒症大鼠脏器功能的改变

y/x相关系数(r)P值回归方程GPT/肝脏SEB0.84620.0040y=0.4249x+56.2483Cr/肾脏SEB0.67060.0480y=0.0283x+37.1327CK-MB/心脏SEB0.78940.0114y=2.1720x+157.7869MPO/肺脏SEB0.43630.2404

DAO/血浆SEB-0.43980.0170y=-0.0042x+0.2339组织SEB与脏器功能指标的相关分析SEB单抗对烫伤脓毒症大鼠6小时死亡率的影响

组别死亡率P值烫伤脓毒症组55.6%(20/36)SEB单抗组17.6%(3/17)0.021

金葡菌肠毒素介导脓毒症发病的分子机制

干扰素-

激活巨噬细胞、中性粒细胞，增强其杀菌活性(保护效应)炎症早期炎症晚期诱导巨噬细胞TNF-、NO等介质大量生成(损害效应)抗原呈递细胞外表MHCII表达增加，促进T细胞依赖性休克、MODS

肠毒素B

T细胞活化JAK2/STAT3SOCS1/3金葡菌致病因子的靶细胞为T淋巴细胞和单核/巨噬细胞(1)肠毒素和TSST-1以T淋巴细胞为主要靶细胞(介导Th1细胞因子反响，包括IFN-)(2)肽聚糖和磷壁酸那么主要作用于单核/巨噬细胞内毒素的靶细胞为单核/巨噬细胞(以TNF-α促炎因子占优势)，且诱导细胞因子反响速度显著快于外毒素金葡菌外毒素与内毒素作用的差异金葡菌TSST-1可显著提高宿主及细胞对内毒素攻击的敏感性，与内毒素发生致死性协同作用，这是该毒素最重要的特性之一。健康家兔单独接受TSST-1仅表现为发热反响，即使剂量高达100g/kg亦不能产生致死效应，提示该毒素本身致死性作用并不强。同时给予低剂量内毒素与TSST-1，动物即可出现典型的TSS病症和体征，表现为呼吸、循环、肝、肾及消化道等多器官功能严重障碍，导致动物死亡。金葡菌外毒素与内毒素的协同效应早期炎症介质(TNF)释放可能与多器官损害相关HMGB1的产生明显晚于其它介质,被称之为“潜在的晚期介质〞

?提示还可能存在TNF-

以外的重要因子介导了内毒素的致死效应拮抗早期介质对临床病人并没有明显的保护作用内毒素对TNF基因缺陷动物亦具有致死效应致死量内毒素攻击，局部动物数天后才出现死亡

HMGB1是否确实参与了失控性炎症反响的发生、开展过程？HMGB1的诱生机制及其作用如何？与严重创、烧伤后脓毒症及器官损害的本质联系和临床意义如何？针对HMGB1进行干预是否有助于脓毒症及多器官损害的防治？课题拟解决的问题HMGB1mRNA腹腔感染脓毒症大鼠组织HMGB1mRNA表达*时间〔小时〕对照组26122448720.96*******************************0.720.480.24ALT(u/L)*正丁酸钠对脓毒症大鼠器官功能指标的影响肝功肾功6050454055Cr(μmol/L)***给小鼠腹腔注射纯化的重组HMGB1攻击可出现脓毒症样表现较大剂量HMGB1攻击可导致动物死亡气管内给予HMGB1可引起急性肺损伤，大量PMN聚积和肺水肿HMGB1的直接组织损害作用炎性因子(TNF-α)上调HMGB1合成HMGB1对TNF-α/IL-10表达的影响HMGB1对Toll样受体表达的影响HMGB1的调节作用HMGB1对淋巴细胞免疫功能的影响〔包括增殖反响、IL-2/IL-2R表达、Th1/Th2极化〕HMGB1对巨噬细胞吞噬、提呈功能的影响HMGB1与严重烧伤后细胞免疫功能紊乱的本质联系及其信号机制HMGB1的免疫效应

抗HMGB1抗体对内毒素休克小鼠的治疗效果

延迟HMGB1抗体治疗组

时间〔小时〕2244872963361007550025存活率〔%〕内毒素休克对照组

正丁酸钠对严重脓毒症大鼠的治疗效果

时间〔天〕212341007550025存活率〔%〕5670.5************正丁酸钠治疗组严重脓毒症组血清HMGB1(ng/ml)正常对照组**脓毒症患者血清HMGB1水平与预后的关系存活组死亡组脓毒症患者*血清HMGB1(ng/ml)休克初期失血性休克患者血清HMGB1水平与血压的关系低血压期血压正常血压恢复期HMGB1出现较晚且持续时间更长，与脓毒症的发生、开展密切相关体液中存在稳定、持续，防止“早期〞细胞因子半衰期短、“脉冲〞式改变的缺陷可能成为反映脓毒症、MODS病理过程更为方便、实用的监测指标检测HMGB1的临床意义

生物喋呤及其调节作用一氧化氮(NO)过度产生是诱发脓毒性休克和MODS的最后共同通路，而生物喋呤(BH4)为一氧化氮合酶重要的辅因子，调控着细胞内NO的产生。尽管BH4确实切病理效应尚未明了，我们的研究发现，它可能作为潜在“炎症因子〞参与了内/外毒素所致脓毒性休克及MODS的病理生理过程。内毒素可刺激多种细胞中GPT-CHI基因/蛋白表达和BH4产生，进而诱导iNOS基因表达。

内/外毒素休克动物肝、肺、肾等组织生物喋呤含量分别与反映相应器官损害的功能指标呈显著正相关关系。中和毒素及GPT-CHI抑制剂可不同程度地抑制组织生物喋呤的合成过程。12生物喋呤在脓毒性休克和MODS中的作用3BH4为iNOS重要辅因子，可促进NO不断合成、释放；NO大量诱生加重内毒素所致血流动力学障碍、细胞毒作用和局部组织损伤。BH4与内/外毒素在诱导iNOS表达及促进TNF-a产生方面具有协同效应,可造成广泛炎症反响。采用GTP-CHI抑制剂或BH4竞争抑制剂能有效拮抗低血压，提高多器官微循环灌注。脓毒症时BH4与MAPKp38激活密切相关。12生物喋呤介导组织损伤效应的机理34新喋呤在体液中存在较稳定，持续时间长，不易灭活或降解，克服了某些炎性介质作为早期诊断指标的缺陷。

通过64例大面积烧伤和41例多发伤病人前瞻性观察，确立了新喋呤对严重脓毒症的预警阈值(35.0nmol/L)。严重烧伤后循环新喋呤水平改变较早，自伤后3天起并发MODS者其含量持续上升，比临床出现MODS提前数天作出判断。发现联合应用新喋呤和内毒素能进一步提高MODS的临床诊断效率。

新喋呤与创、烧伤后严重脓毒症及MODS的关系

血清新喋呤含量与MODS积分值的关系伤后时间〔天〕项目137142128新喋呤/积分值r值-0.1770.4700.7220.2640.8110.080P值>0.05<0.05<0.01>0.05<0.01>0.05

敏感性特异性准确性阳性阴性