PCR体系优化(新)课件

荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR程扬健厦门大学生命科学院分子诊断实验室1精选2021版课件认识它们吗？！2精选2021版课件什么是Ct值和Δ

Rn？Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Δ

Rn:相对荧光强度Ct(S/B)3精选2021版课件为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量4精选2021版课件实时荧光PCR是如何定量？利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。在一定范围:Ct值∝1lgC5精选2021版课件PCR检测过程样品处理PCR扩增结果检测RealtimePCR6精选2021版课件实时荧光定量PCR优化目标1、Ct值2、ΔRn值3、R值7精选2021版课件优化内容引物设计和筛选

探针设计和筛选反应体系的优化反应程序的优化

HCV分子信标8精选2021版课件引物的设计与筛选1序列查找与比对9精选2021版课件附：主要数据库的网址数据库组织网址MEDLINENationalLibraryofMedicine

GenBankNationalCenterforBiotechnologyInformationEMBLEuropeanBioinformaticsInstitutewww.ebi.ac.uk

DDBJNationalInstituteofGenetics,Japanwww.ddbj.nig.ac.jp

SWISS-PROTSwissInstitutesofBioinformaticswww.expasy.ch

PIRNationalBiomedicalResearchFoundationPRFProteinResearchFoundation,Japanwww.prf.or.jp

PDBResearchcollaboratoryforStructuralbioinformatics

CSDCambridgeCrystallographicDataCenterwww.ccdc.cam.ac.uk10精选2021版课件二级结构分析条件：42℃；50mMNa+;2.5mMMg2+/~zukerm/rna/引物的设计与筛选211精选2021版课件HCV5’

UTR引物设计5’3’HCV引物的设计与筛选312精选2021版课件引物筛选结果12345引物的设计与筛选413精选2021版课件引物用量的优化不对称PCR（S/A=1：4）Vs对称PCR（S/A=1：1）引物的设计与筛选514精选2021版课件探针设计和筛选1探针设计15精选2021版课件探针设计和筛选2探针的Tm值16精选2021版课件＋探针设计和筛选3退火温度的确定17精选2021版课件探针用量的优化0.6uM0.3uM0.15uM探针设计和筛选418精选2021版课件不同TaqE的比较Taq1Taq2反应体系的优化119精选2021版课件TaqE浓度的优化0.5U/T1.0U/T2.0U/T3.0U/T反应体系的优化220精选2021版课件dNTP浓度的优化20uM/T10uM/T40uM/T80uM/T反应体系的优化321精选2021版课件Mg2+对荧光强度的影响22精选2021版课件Mg2+和退火温度的优化

--------(方阵法）

23精选2021版课件PCR促进剂的影响

24精选2021版课件AMV与M-MLV的比较M-MLVAMV25精选2021版课件M-MLV的用量的优化WellCtF1 27.373F2 30.291F5 26.144F6 29.143G1 26.205G2 29.896G5 26.221G6 29.661H2 26.279H3 29.854H4 0.00010u/test20u/test30u/test40u/test50u/testNTCF6F526精选2021版课件高浓度RNA低浓度RNA比较了四个浓度：24U/T12U/T

8U/T4U/TRNA酶抑制剂浓度的优化27精选2021版课件成分作用优化前浓度优化后浓度上游引物DNA正链扩增引物0.15uM0.15uM下游引物RNA逆转录和DNA负链扩增引物0.15uM0.6uM探针与模板杂交，发送信号0.15uM0.6uMTaq酶合成双链DNA1.2U/T2U/TdNTP为模板复制提供原料20uM/T20uM/T镁离子支持Taq酶活性1.5mmol2.5mmol逆转录酶将RNA逆转录成cDNA30U/T20U/TRNA酶抑制剂防止RNA降解12U/T12U/T扩增缓冲液提供稳定的反应环境pH8.6pH8.6优化前后含量对比28精选2021版课件逆转录时间的比较逆转录时间（30min；45min；60min）45min反应程序的优化29精选2021版课件RT-PCR扩增程序优化RT-PCR扩增程序（优化前）42度，60分钟95度，3分钟95度，30秒55度，20秒逆转录预变性延伸RT-PCR扩增程序（优化后）42度，45分钟95度，3分钟95度，10秒58度，45秒逆转录预变性50个循环45个循环72度，20秒退火变性退火延伸反应程序的优化变性30精选2021版课件优化前后的比较优化后优化前31精选2021版课件多色荧光PCR双色荧光PCR三色荧光PCR多色荧光PCR32精选2021版课件多色荧光PCR的特点①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.

33精选2021版课件双色荧光PCR不加内标（单色PCR)加人内标(双色PCR）FAMJOE34精选2021版课件三色荧光PCRFAMHEXTexas