第六章 植物的离体微繁

第六章植物的离体微繁植物离体微繁的概念和发展植物离体微繁的一般方法试管苗增殖率的估算及实际可能性影响离体微繁的因素离体微繁中存在的主要问题试管微茎无糖微繁技术植物离体微繁的应用6.1植物离体微繁的概念和发展

6.1.1植物离体微繁的概念

又称微体繁殖、试管繁殖或离体繁殖，是指利用植物组织培养方法对分离的植物外植体进行离体培养，通过诱导外植体的增殖在短期内获得遗传性一致的大量再生个体的技术。月季丛芽6.1.2植物离体微繁的发展

1960年，Morel和Martin建立了兰花微繁增殖的体系。可使一个兰花茎尖在一年内生产出400万株在遗传性上和母本植株完全相同的兰花植株，开创了组织培养法进行植物快速繁殖的先例。1958年，Wickson和Thimann利用茎尖培养得到微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。

以上四人的研究建立了植物试管微繁研究与利用的基础，这一技术不仅是对兰花种植业的革命，而且开辟了利用茎尖培养法快速繁殖其它重要植物的新途径。金丝桃1982年Kim首先报道了马铃薯试管微薯的诱导方法，PilarTovar（1985）、RolandoLizarrage（1989）也报道了这方面的工作，试管微薯的诱导为利用地下茎繁殖的植物的微繁殖开创了另一个新途径。20世纪80年代末，日本千叶大学Kozal教授发明了无糖微繁技术。可以实现幼茎的生根及胚状体的分化等目的。据初步统计，从20世纪60年代至今，人们已用各种微繁技术成功培育了1226个属的2776种植物，欧美发达国家的许多重要花卉已基本实现试管产业化的生产。6.1.3植物离体微繁的特点（1）繁殖效率高；（2）占用空间少；（3）微繁培养条件可控性强，不受季节和灾害性气候的影响；（4）管理方便，同时便于种质的保存和交换。6.2植物离体微繁的一般方法

6.2.1植物离体微繁的过程五个阶段无菌培养物的建立诱导中间繁殖体的生长与分化中间繁殖体的增殖试管苗的壮苗和生根试管苗的出瓶移栽与管理6.2.1.1无菌培养物的建立6.2.1.2中间繁殖体的生长与分化四种方式供体植株选择外植体取样和表面灭菌接种与培养顶芽和腋芽的发育

不定芽的发育体细胞胚的发生与发育A切取外植体；B形成的原球茎原球茎的发育6.2.1.3中间繁殖体的增殖地灵（左）和芦荟（右）增殖（陈耀锋，2001）香蕉试管苗.脱毒马铃薯

6.2.1.4壮苗与生根

葡萄试管苗壮苗生根（左）及炼苗（右）（陈耀锋，1996）在此阶段多采用1／2或1／4的MS培养基，全部去掉或仅用很低浓度的细胞分裂素，并加入适量的生长素（如NAA、IAA和IBA等）试管内生根或壮苗，减少培养基中糖含量（一半）和提高光照强度（提高到1000～3000Lx或5000Lx）。使它们减少对异养条件的依赖，逐步提高其光合自养能力，同时，试管苗出瓶前应打开瓶口炼苗3～5d。6.2.1.5试管苗出瓶移植与管理必须注意：（1）保持试管苗出瓶后的水分平衡。（2）选择疏松通气、易消毒处理的栽培介质。（3）防止移植介质及周边环境中菌类滋生。（4）加强光照与温度管理。蛭石粗沙珍珠岩锯木屑树皮取样，表面消毒，接种，污染和褐变检查分化再生顺利，标志第二阶段完成；迅速增殖，繁殖体积累，标志第三阶段完成选定植物材料查阅文献，设计培养基供体植株选择和处理无菌培养物建立继代成功，标志无菌培养的建立，第一阶段完成中间繁殖体分化、再生与增殖壮苗和生根驯化或移植，幼苗期管理、成活移栽或插植成活，标志第五阶段完成生根顺利，标志第四阶段完成盆栽、地植、销售试管微繁程序简图6.3试管苗增殖率的估算及实际可能性6.3.1繁殖系数繁殖系数（propagationcoefficient）：是指在一次继代培养中由一个苗（芽或芽丛）得到新苗的个数。

T（繁殖系数）=Nt（繁殖得到的新苗数）／N0（原有苗数）连续培养若干代，分别算出各代的繁殖系数，再求其平均值。6.3.2繁殖速度和增殖倍数

繁殖速度（propagationvelocity）是指在一段时间（例如一年）内由一个苗经几代连续繁殖得到的新苗数。如将N0个苗，连续进行扩大繁殖，其繁殖系数为t，各次培养所得的苗数应为：第一代培养得苗数为：N1＝N0×t＝N0t第二代培养得苗数为：N2＝N1×t＝N0t2

同样，第三代得苗数为：N3=N1×t=N0t3则第n代培养得苗数为：Nn=N0tn又设：N＝Nn／N0则有N＝tn。这里N即可定义为：经过n代培养后试管苗的增殖倍数。“连续繁殖”，是指每一次均将前一次培养所得的全部苗用于再繁殖。如葡萄，繁殖系数4，一年繁殖10代，则有：

N＝

tn=410=1048576即在一年内苗增殖1百万倍以上。6.3.3有效繁殖系数和实际增殖倍数

第一次培养由一个苗得到t个苗，在进行第二代培养时，取出数量为a的苗做生根之用，而仅用t-a＝k的苗进行再繁殖；k即为有效繁殖系数，a可称为诱导生根苗指数；以后一直保持k为有效繁殖系数，即取数量为k的苗用于再繁殖，其余转入到生根培养基中，经过n代培养后，繁殖产生的苗总数Pn＝N0·（t-a）n=N0·Kn。令P=Pn／N0=Kn，P即可称之为实际繁殖速度或实际增殖倍数。6.3.4苗木的产率繁殖后的试管苗，须经生根、移栽成活、成为商品苗阶段。如果用fr代表诱导生根率，fv代表移栽成活率，fe代表商品苗占全部移栽成活苗的百分率，

则f＝fr×fv×fe，f即为从诱导生根苗得到合格商品苗的百分率。可称之为繁殖效率由一个苗所得的用于诱导生根的全部苗总量定为M，这个繁殖体系中的苗木产量率定为S，则S=M×f。6.4影响离体微繁的因素

基因型外植体：用于快繁的主要有幼叶、茎尖分生组织、种子、鳞茎、球茎、根茎、花序、茎段等。供试植株的生理状态芽在植株上的部位供试植株的年龄培养基培养条件极性后生变异：离体培养形成的小植株在培养时受到的影响，可能会继续影响移植到自然环境中的植株生长，产生一定的变异。6.5离体微繁中存在的主要问题6.5.1褐变

与菌类污染和玻璃化一起被称为组织培养中的三大障碍。原因：材料的生理状态、培养基成分、外植体大小、人为切割等。克服的措施：选择适当的外植体和培养条件、抗氧化剂和抑制剂的作用、连续转移和预处理。6.5.2玻璃化

试管苗玻璃化（vitrification）是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。6.5.2.1玻璃化苗的形态学、解剖学特征

形态上，水渍化呈半透明状，植株矮小肿胀，茎尖顶端分生组织相对较小，保持分生组织特性的时期也缩短，节间短或几乎没有，叶表面缩小或增大，叶片常皱缩并纵向卷曲，脆弱易破碎，其颜色不正常。八宝景天正常苗八宝景天玻璃化苗显微学观察表明，玻璃化苗一般茎皮层及髓部的薄壁组织过度伸长、细胞间隙大、输导组织发育不良或畸形，导管和管胞木质化不完全。叶片栅栏组织细胞层数减少，或仅有海绵组织，叶肉细胞间隙大。车轮棠玻璃化与正常芽和叶片显微结构的对比6.5.2.2玻璃化苗的生理生化特点

细胞中含水量高，叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等含量较低。牛自勉等研究发现苹果玻璃化苗的叶片及茎尖中GA3、IAA、ABA含量极显著上升，而CTK含量则显著下降。hyperhydricityinOreopanax（及山参属）

nymphaefolia6.5.2.3影响试管苗玻璃化的因素外植体：外植体类型及大小培养的环境条件：光照、温度、湿度、pH值。培养基成分：Ms培养基是控制玻璃化发生较理想的培养基，培养基中增加K、P、Fe、Ca、Mn、Zn元素的含量，降低B含量，增加硝态氮，降低铵态氮，可起到降低玻璃化率的作用。玛卡6.5.2.4玻璃化苗的综合控制

选择合适的外植体：玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎切段培养物的不定芽。改善培养基组成：适当降低培养基中NH4+浓度，适当添加IAA、GA3、ABA，减少BA用量均可降低玻璃化苗的发生频率。改善培养条件：适当提高培养时的光照强度，延长光照时间，降低培养容器内的空气相对湿度，改善供氧状况，采用有透气膜的培养容器等培养条件的改良均可以降低玻璃化苗的发生频率。6.5.3遗传的稳定性实践证明，茎尖分生组织是遗传学上最稳定的部分，通过顶芽和腋芽繁殖途径进行增殖是最能保持原品种优良特性的繁殖方式.变异的白花贝母兰白花贝母兰组培苗6.5.4污染6.5.4.1来源：植物材料本身（表面、内生菌）；在无菌操作和培养过程中由外界环境

进入培养容器而引起的。6.5.4.2污染的症状：

2～3d产生菌落——表面灭菌不彻底；3～5d后陆续产生——内生菌所致。6.5.4.3污染所引起的危害：引起早期培养的失败，试管苗生长速度减慢、生活力下降、增殖效率降低、玻璃苗增加及生长不均匀、叶片失绿甚至死亡等；在后期导致试管苗移栽困难和死亡；污染也会引起培养物的遗传变异。6.5.4.4

污染的防止

供体材料的选择：尽可能使用温室和人工气候条件中培养的健康、无病虫害植物作材料。培养物的检测：特别要注意培养物和培养基接触的部分。合理的扩繁殖程序：将最初的无菌培养物中一部分作为“原原种”进行专门保存，分批繁殖和复检后再进行大规模生产。严格无菌操作规程6.5.4.5已污染培养物的处理抗菌素：弄清楚要抑制菌的种类；使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响；还要确立抗生素的使用浓度、处理时间的长短。希望采取一些措施恢复无菌状态，方法之一是使培养物在试管内长成小植株后移栽，待它生长成健壮的幼苗后再重新消毒接种。另一种方法在一个较大的容器中生长，适当降低容器中的相对湿度，待植株长到一定高度后取较大的茎尖重新消毒接种，但这种方法对已污染的愈伤组织和有内生菌的材料将不起作用。6.6试管微茎6.6.1试管微茎的概念试管微茎（microstem）是利用植物细胞全能性原理，在离体培养条件下，通过对培养条件及培养基的调整，诱导植物的离体组织或试管苗在容器内形成微型变态茎的植物离体培养技术。百合试管小鳞茎、半夏试管茎、魔芋试管微球茎、郁金香试管鳞茎、马蹄莲试管块茎、怀山药试管块茎、芋试管球茎、试管姜等相继诱导成功。变态茎6.6.2试管微茎的意义

试管微茎的意义在于与试管苗相比具有几个重要的特点：（1）试管微茎可以由脱毒苗形成，具有试管微繁的所有特点，同时更方便运输；（2）利用试管微繁技术诱导试管茎，对于深入研究试管茎的形成、发育和调控机理，揭示植物地下茎形成机制等都具有十分重要的意义；（3）试管微茎是进行植物遗传转化的良好受体。6.6.3试管微茎诱导的一般方法液体培养体系固液双层培养体系固体直接诱导培养体系液体和固液双层培养体系诱导培养60d，固体直接诱导培养30d后，可以获得试管微薯。6.6.4影响试管微茎发生的因素

外植体培养基：提高培养基中P和K、Ca的供应比例有利于提高试管茎产量；在原MS基础上将锰增加1倍，铁和铜增加0.5倍可显著提高马铃薯试管薯的产量和品质（李会珍，2003）。激素：主要有6BA、NAA、IAA、BAP、CCC、SA和多效唑等。糖的种类和浓度：大多以蔗糖为碳源，浓度30～90g/L温度和光照：荸荠在18℃时形成的试管球茎数最多，鲜重最大；马铃薯在诱导结薯阶段温度为18～20℃。马铃薯茎段在固体MS培养基（MS十3%蔗糖+0.8%琼脂）中培养21d（光强2000Lx、光周期16h/d、25士1℃）后，转入液体诱导结薯培养基（MS+5mg/LBA十500mg/LCCC+8%蔗糖），全