革兰氏染色法

09级生科一班张健200900140167细菌的简单染色法与革兰氏染色法一、目的要求1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。2.初步认识细菌的形态特征。3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。4.了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法二、基本原理1.简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。2．革兰氏染色法革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的．实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色．革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色．三、实验器材1.菌种枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌2.染色剂草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，革兰氏染色液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等3.仪器或其他用具显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。四、操作步骤（一）.简单染色法1.涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1~2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作（图Ⅳ-1，具体操作参照实验一）分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌球菌、大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2~3环直接涂于载玻片上。载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。2.干燥：室温自然干燥。3.固定涂面朝上，通过火焰2~3次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4.染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。5.水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宣过急，过丸以免涂片薄膜脱落。6.干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。7.镜检涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。（二）革兰氏染色法1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2.染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。五．观察结果菌名菌体染色后颜色细菌形态结果（G﹢，G﹣）大肠杆菌红色两端纯圆的短小杆菌G﹣金黄色葡萄球菌紫红色呈葡萄串状，单个球状G﹢枯草杆菌紫色菌群呈枯草状，单个杆状G﹢自选未知菌红色杆状个体G﹣金黄色葡萄球菌枯草杆菌大肠杆菌自选未知菌六．思考题1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节?答：加热固定，染色时间2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?答：因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?未经加热，水分蒸发太慢，制片时间过长；加热温度过高或时间过长会导致菌体变形或形态破坏。4.微生物实验制片是否都需要染色？不是，有的微生物细胞内含有色素，不用染色也可以看得很清楚。5.革兰氏染色是否成功,有哪些问题要注意，为什么?涂片的厚薄和脱色时间的掌握，是革兰染色成败的关键。6.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使细胞壁的成分和通透性均发生了改变，使结晶紫染液容易在脱色中被