Westernblot操作流程课件

蛋白印迹杂交——Westernblot张蕾Westernblot的原理

利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜或PVDF膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法

实验流程样本制备显影孵育抗体电泳分离电转印迹培养细胞总蛋白的提取收集细胞：2000rpm/min，5min后弃上清加PBS洗一次，2000rpm/min，5min加入200-600ulRIPA混匀（液体清澈透明），后置于冰上10-30min100℃,10min后置于冰上冷却15000rpm/min,5min后取上清，分装后-20℃保存蛋白质样品制备组织中总蛋白的提取0.1g加入0.8mlRIPA（强）裂解液用干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆考马斯亮兰染色法(CBB法，Bradford法)原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。BCA(二喹啉甲酸)法原理：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA

Solution

A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。蛋白质含量的测定操作步骤：绘制标准曲线（BSA标准品：0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg/ml）蛋白样品吸光度值测定蛋白浓度计算蛋白质含量的测定电泳分离浓缩效应电荷效应分子筛效应三大效应：电转印迹湿转法半干转移法带手套操作转膜时间：根据分子量的大小决定电转印迹根据目的蛋白分子量的大小选择分离胶的浓度电转印迹凝胶对应负极,膜对应正极膜的选择要得到有意义的结果，抗体必须只结合目标蛋白而不与膜结合，用惰性蛋白或非离子去污剂封闭膜上的结合位点可以降低抗体的非特异性结合,封闭剂与膜的亲和力应大于抗体。它应该封闭所有的未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。做到磷酸化项目时，就不能用牛奶了，要用BSA，因为牛奶里含有一些磷酸化酶。封闭用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

孵育及洗膜

抗体的选择印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可见的区带，即指示目的蛋白的位置酶联的二抗：辣根过氧化物酶体系(HRP)：DAB显色或化学发光试剂显影（ECL）碱性磷酸酶体系(AP)：BCIP+NBT显色显色或显影ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在H2O2的存在下，使底物(化学发光物质鲁米那)发生氧化还原反应，从而发出荧光。成像

内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。关于内参提取蛋白，测定含量SDS转膜封闭一抗结合实验流程NC膜：水10min5%的脱脂奶粉inPBS-TorTBS-T，RT，1h

PBS-T或TBS-T稀释，37℃,1h或4℃过夜

30-100ugHRP-二抗结合洗膜ECL发光试剂作用X-光片曝光显影、定影结果分析洗膜PBS-TandTBS-T，5min×3次

PBS-T