TF对雏鸡脾脏IFN-γ基因表达的影响

TF对雏鸡脾脏IFN-γ基因表达的影响摘要：研究牛脾转移因子（TF）对雏鸡脾脏干扰素γ（IFN-γ）的基因表达影响，找到促进雏鸡免疫功能的最佳免疫途径。实验样本为7日龄的罗曼粉雏鸡48只，将其分4个组，其中Ⅰ组是对照组，Ⅱ组，Ⅲ组，Ⅳ组是实验组。Ⅰ组使用生理盐水注入；Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组使用TF，其中Ⅱ组为口服注入，Ⅲ组为肌肉注射，Ⅳ组为皮下注射，四个组的剂量都是每只0.2ml。在第14天日龄和第21天日龄时，分别在每个组随机选4只雏鸡，测定雏鸡脾脏脏器指数变化，进行脾脏组织学观察及脾脏IFN-γ基因表达测定。结果显示：在21日龄时实验组雏鸡样本脾脏器官指数与对照组相比有差异（p＞0.05）；与对照组脾脏IFN-γ基因表达水平相比，14日龄时，实验组分析值P<0.01，21日龄时，肌肉注射组和皮下注射组实验分析值P<0.01，差异性都极显著，口服给药组分析值p<0.05，皮下注射与口服，肌注相比分析值p<0.01为显著。因此，TF对于雏鸡IFN-γ的基因表达有一定增强功能，且皮下注射更佳。关键词：转移因子；脾脏；IFN-γ；免疫功能EffectofBovineSpleenTransferFactoronGeneExpressionofIFN-γinChickenspleenAbstract：Objectivetostudytheeffectofbovinespleentransferfactor(TF)oninterferoninchickenspleenγ（IFN-γ）Inordertofindthebestwaytopromotetheimmunefunctionofchickens.Fortyeight7-day-oldRomanpinkchickensweredividedintofourgroups:controlgroup(groupI),experimentalgroup(GroupII),experimentalgroup(GroupIII)andexperimentalgroup(GroupIV).GroupIwasinjectedwithnormalsaline;GroupII,groupIIIandgroupIVweretreatedwithTF,ofwhichgroupIIwasgivenoralinjection,groupIIIwasgivenintramuscularinjection,andgroupIVwasgivensubcutaneousinjection.Thedoseofeachanimalinthefourgroupswas0.2ml.Attheageof14daysand21days,4chickensineachgroupwererandomlyselectedtomeasurethechangesofspleenorganindex,histologicalobservationandIFNofspleen-γGeneexpressionassay.Theresultsshowedthat:attheageof21days,thespleenorganindexoftheexperimentalgroupwasdifferentfromthatofthecontrolgroup(P>0.05);Comparedwiththecontrolgroup,IFNinspleenofthecontrolgroup-γComparedwiththegeneexpressionlevel,at14daysofage,theanalysisvalueoftheexperimentalgroupwasp<0.01,at21daysofage,theanalysisvalueoftheintramuscularinjectiongroupandthesubcutaneousinjectiongroupwasp<0.01,thedifferencewasextremelysignificant,theanalysisvalueoftheoraladministrationgroupwasP<0.05,theanalysisvalueofthesubcutaneousinjectionandtheoraladministration,theintramuscularinjectionwasp<0.01.Therefore,TFisveryimportantforchickenIFN-γThegeneexpressionwasenhancedtoacertainextent,andsubcutaneousinjectionwasbetter.Keywords:transferfactor;spleen;IFN-γ;immunefunction转移因子（TransferFactor,TF）是一类可透析的小分子多肽，具有免疫活性的T淋巴细胞在受到抗原或丝裂原刺激下释放产生。[1-2]。转移因子能够扩展细胞的免疫力，是一种免疫激发剂[3]。转移因子还可以促进生长发育和其他细胞因子的合成和活性[4-6]，在人类医学领域，对于肿瘤和AIDS，特别是对病毒性疾病，转移因子应用于临床治疗有明显效果。也可以应用于畜禽疾病防治，其作为一种免疫性辅剂，可与疫苗协同配合，有效提高生命机体中细胞和体液的免疫功能，使疫苗在机体内的效用得到更大发挥。[7]。干扰素（Interferon，IFN）是本质是一种蛋白质，病毒感染细胞的时候会产生干扰素，对感染进行调控后具有免疫和获得性免疫反应[8]。国际上通常按照干扰素抗原的特异性，将其分成三种：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。[9]IFN-γ能够抑制病毒和肿瘤，还可以调控免疫，应用于慢性肉芽肿、恶性骨硬化病和先天肺纤维化的临床治疗[10]。目前虽已有关于牛脾转移因子对鸡新城疫疫苗免疫应答方面的研究报道，但是牛脾转移因子对雏鸡脾脏IFN-γ的基因表达的影响，还未见报道。本研究在实验中探索牛脾转移因子对雏鸡脾脏IFN-γ基因表达的影响，以及使用三种注入方式对该基因表达的影响，进而探索转移因子对雏鸡机体细胞免疫能力的影响，发现哪种注入方式最为有效，并以此为依据确立牛脾转移因子的应用方式，为新城疫预防提供参考。1材料和方法1.1材料1.1.1试验地点动物医学院病理实验室6-118。1.1.2试验动物试验动物选用健康1日龄罗曼粉雄鸡共48只，购自四川某养鸡有限公司，饲养于四川农业大学成都校区动物房。日粮以正大小鸡饲料为主。1.1.3主要试剂牛脾转移因子（多肽含量2mg/ml），由四川农业大学动物医学院鱼病中心提供;鸡新城疫疫苗CS2株（哈药集团生物制剂有限公司欣匹克La

Sota株2016

080072007）；生理盐水、荧光定量试剂盒（SYBR

Premix

Ex

Taq

II，Takara，中国）；反转录试剂盒（Prim-Script

RT

reagent

Kit，Takara，中国）和总RNA试剂盒（RNAiso

Plus，Takara，中国）、无水乙醇、苏木精、伊红、二甲苯等。1.1.4主要设备及耗材超净工作台SW-CJ-1F（苏净集团安泰公司）、低速离心机（TDZ4-WS低速台式离心机）、超纯水器（优普公司）

、JA12002型号电子天平（上海分析仪器厂）

、移液枪（20-200μL）

、

V型血凝板、冰箱、离心管、荧光定量pcr仪（C1000

ThermalCycler）、计时器等。1.2方法1.2.1实验分组和管理实验样本是48只肌体健康的7日龄雏鸡，称量最初体重后无差别的分为4组，即Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组，驯化7d后全部接种ND疫苗。设Ⅰ组为对照组仅注射生理盐水，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组为实验组使用TF注射，其中Ⅱ组为口服注入，Ⅲ组为肌肉注射，Ⅳ组为皮下注射，均为每只0.2ml的剂量，每一组3个重复，每个重复4只。在实验的第14d和第21d采集样本，具体给药方式见表1。表1分组及试验方法分组IIIIIIIV给药方式无口服肌肉注射皮下注射给TF数量/mL01.2.2指标检测体重和免疫器官指数的测定在第14与21日龄时，提前12h从每组随机抽取4只鸡进行免水禁食，在清晨进行空腹称重，称量后将样本进行解剖，将样本脾脏进行分离后再次称重，计量出脾脏指数。免疫器官指数（%）=[免疫器官鲜重（g）／宰前空腹活重（kg）]×100%（2）脾脏组织学变化动物注射TF14d、21d后，从试验雏鸡中每组偶然抽取四个样本处死，取出脾脏，去除表面脂肪等物质，清水洗干净后，放进10%福尔马林溶液中浸泡72h。浸泡后再将脾脏脱水、透明、石蜡包埋、切片、粘片、HE染色，树胶封固，烘干过夜。脾脏干扰素-γ的基因表达测定用荧光定量PCR技术检测样本雏鸡中脾脏IL-2mRNA的相对表达量[11]。具体步骤如下：①总RNA的提取和cDNA的合成在每一组注射TF14d和21d的雏鸡中随机选取6个样本进行总RNA的提取，提取RNA时所使用的试管等器材用0.1%的焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）试剂先进行预处理，隔夜后再高压灭菌，之后参照试剂盒的附带操作说明进行提取的操作步骤。琼脂糖凝胶凝胶电泳检测样品中RNA的完整性，对提取所提取RNA的浓度和纯度，用紫外分光光度计进行测定。用第一链合成试剂盒(TIANScriptcDNA)，对所提取的RNA抽取1微克，逆转录得到cDNA。②引物的设计和合成荧光定量（PCR）对引物的要求：长度（18-25bp），G/C含量（40%-60%），扩增产物（300bp），其中扩增产物要能够清楚地进行区分，无特异性。用表达稳定的β-actin基因作为内参。参照PCR要求，对引物参数进行设定后，委托大连宝生物公司合成，见下表2：表2鸡细胞因子基因引物基因名称登录号引物引物序列（5′-3′）产物Tm(°C)IFN-γY07922ForwardAGCTGACGGTGGACCTATTATT157bp58ReverseGGCTTTGCGCTGGATTC③反应程序95℃温度下进行预变性操作3min，继续在95℃温度下进行变性操作10s，接着退火30s（据引物定），并进行44个循环操作；95℃、10s；72℃、10s（温度变化率是0.5℃/s），检测使用PCR仪。④数据处理β-actin基因与目的基因在扩增后得到Ct值，使用以下公式，对mRNA基因分析。目的基因（mRNA）相对定量=2-ΔΔCtCt值是热循环反应体系中，检测到的荧光信号强度值，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）试验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，因此推出2-ΔΔCt赋值是试验组的目的基因相对定量。1.2.3数据统计与分析使用SPSS（22.0）进行分析，结果以平均数（）±标准差（SD）表示。每个实验组的均数间，借助单因素方差分析法（one-wayANOVA），进行差异显著性分析（p<0.05为显著，p<0.01为极显著）。附：技术路线处理实验数据处理实验数据,并进行结果分析脾脏指数测定脾脏组织观察荧光定量PCR法测定IFN-γ相对表达量实验材料准备（动物、试剂、器材）动物分组新城疫疫苗接种与TF给药对照组口服组皮下注射组肌肉注射组2结果2.1脾脏器官指数分析结果显示，在14日龄时实验组对照组间差异不显著，在21日龄时（III组）肌肉注射组和（IV组）皮下注射组，分别与对照组相比有一定程度的增加担仍然不显著（p>0.05）见表3：表3体重与脾脏指数日龄（I组）对照组（II组）口服组（III组）肌肉注射组（IV组）皮下注射组140.9±0.050.8±0.050.90±0.040.96±0.07210.9±0.061.0±0.021.12±0.051.13±0.072.2雏鸡脾脏组织切片HE染色切片各个组的雏鸡样本脾脏中，白髓区和红髓区的淋巴细胞呈现紧密均匀的分布状态，淋巴滤泡的结构较清晰，没有发现组织学上的异常变化，见图2所示：图图2雏鸡脾脏组织切片HE染色切片100×14d21d对照组口服组肌肉注射组皮下注射组2.3IFN-γ基因表达变化。实验发现，在14日龄时，实验组与对照组相比较差异性极显著（p<0.01）。21日龄时，（Ⅱ组）口服组、（Ⅲ组）肌注组、（Ⅳ组）皮注组三组与对照组相比较，有极显著的差异性，如表4所示：表4IFN-γ基因表达情况日龄对照组口服组肌肉注射组皮下注射组141.00±09.80±1.40**20.89±2.99**25.55±2.60**211.00±038.98±5.39*98.71±11.19**223.39±45.51**注：同列数据后标不同符号表示差异显著性：*为显著，**为极显著。3讨论3.1转移因子对脾脏脏器指数的影响转移因子具有能够促进机体生长和发育的作用。江青艳[6]等人采用注射给药鸡脾转移因子，验证STF对机体脾脏的发育产生了一定的抑制（脾脏相对重量低于对照组），原因不明。李世钊[2]等人采用注射0.4~0.6mg/只（相当于本试验转移因子的0.2ml~0.3ml）剂量的牛脾转移因子，结果表明TF可不同程度地提高雏鸡的生长性能，其中脾脏各组与对照组相比均无显著性差异。实验研究中21日龄的雏鸡样本，其脾脏指数与对照组雏鸡样本的脾脏指数比较无显著性差异(p>0.05)，推断可能转移因子对脾脏脏器指数影响不明显。3.2转移因子对IFN-γ促进作用的分析本试验证明了牛脾转移因子对雏鸡脾脏IFN-γ基因表达具有显著的促进作用（(P<0.01)），徐磊[12]等测试了TF与鸡新城疫病毒活疫苗联合接种对SPF鸡外周血中细胞因子的影响，发现IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度较空白组显著提高，这和我的试验相同，表明TF作为细胞调节剂，可有效调节机体细胞因子水平3.3给药方式对增免效果的影响实验结果证明，TF对消化酶比如胃蛋白酶等，以及核酸酶如DNA酶、RNA酶具有抵抗性，这一特性能够保证TF在胃肠内不会遭到酶的分解破坏，使其在维持原本状态下被吸收，因此TF既可以口服也可以注射使用。李丛壁等[13]研究发现，无论是口服还是注射，摄入TF后，巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率，以及迟发型变态反应方面均无显著性差异。陈德坤等[14]研究表明，采用口服和注射的不同方式使健康小鼠摄入不同剂量的TF，这两种方式在提高其外周血中性粒细胞及腹腔巨噬细胞的吞噬率方面无明显差异，且吞噬率的高低和TF的摄入剂量在一定范围内呈现正相关关系。因此，研究证实，TF口服和注射后均效果显著。对比以上研究的剂量和注射方式，推测本实验口服、肌注给药方式出现差异是因剂量不足所致，但也难以排除动物种属和测定标准等因素。且以上试验未见雏鸡皮下注射给药试验，但根据本实验结果，皮下注射是最佳给药方式。4结论通过本实验研究结果显示，牛脾转移因子能在一定程度上增强雏鸡脾脏IFN-γ的基因表达，从而一定程度上提高机体的部分免疫功能，且通过皮下注射效果更佳。参考文献[1]李鑫.转移因子的研究进展[J].畜禽业,2010(6):38-40.李世钊,赖为民,刘哲,等.牛脾转移因子对雏鸡免疫功能的影响研究[J].核农学报,2018.32(4):817-824.王永明,王晓丽,朱万光,等.转移因子的研究进展[J].\t"/kns8/defaultresult/_blank"上海畜牧兽医通讯,2009,(03):9-10.张方信,袁爱力,梁守德,等.抗肝癌iRNA及S-TF对肝癌患者LAK活性、IL-2活性及IL-2R表达的调节效应[J].肿瘤防治研究,1997,24(2):84-87.王建文,牟其芸,孙月平,等.鸡脾脏转移因