红白蚕石丸中柚皮苷的含量测定研究 定稿

目录[摘要] 红白蚕石丸中柚皮苷的含量测定研究[摘要]目的：进行红白蚕石丸中柚皮苷的含量测定研究，为建立其质量标准提供参考。方法：HPLC法同时测定制剂中柚皮苷的含量。结果：HPLC法测定同时测定制剂中的柚皮苷的含量，方法灵敏、简便、重复性好。结论：该方法可以作为红白蚕石丸的含量测定方法。[关键词]红白蚕石丸；鉴别；检查；含量测定StudyonqualitystandardofHongbaicanshipellets[Abstract]Object:TodeterminethecontentofnaringininHongbaiCanshiWan,andtoprovideareferenceforitsconstructionofqualitystandards.Method:SimultaneouslydeterminethecontentofnaringininthepreparationbyHPLC.Results:TheHPLCmethodisusedtodeterminethecontentofnaringininthepreparationatthesametime.Thismethodissimpler,moresensitive,andhasgoodrepeatability.Conclusion:ThismethodcanbeusedasamethodforthedeterminationofthecontentofHongbaiCanshiWan.[Keywords]Redandwhitesilkwormstonepills;Identify;examination;Determinationofcontent红白蚕石丸全方由生磁石粉、白矾、炒僵蚕、法半夏、天麻、化橘红等药材组成，具有熄风镇惊，平肝安神的功能，临床主要用于治疗头目眩晕，目胀耳鸣，肢麻震颤，语言不利，步履不稳等之效[1]。为建立该制剂的质量标准，有效控制成品的质量，采用HPLC法对制剂中柚皮苷的含量进行了测定，为建立其可行、可控的质量标准提供了充分的科学依据。红白蚕石丸组方中含有化橘红，其所含柚皮苷成分是该药物的主要有效成分，柚皮苷是一种二氢黄酮类物质，主要存在于柚及其变种的果皮及果实中，具有抗氧化性、抗肿瘤、抑制微生物活性和抗骨质疏松等作用，具有很高的药用价值，应用范围广泛[2]。为探讨本制剂的内在质量，制定该药物的定量质控标准，参考2015版中国药典一部及相关参考文献中的含测方法，对红白蚕石丸样品中的柚皮苷建立了高效液相色谱含测方法。本法操作简单易行，结果准确、灵敏、专属性强、重现性好，是控制红白蚕石丸制剂内在质量的较理想方法。本文建立的质量控制方法准确可靠,为控制该制剂的质量提供了依据。1仪器与试剂表1仪器型号生产厂家含量测定用高效液相色谱仪Ultimate3000二极管阵列检测器紫外检测器Ultimate3000美国Thermo公司工作站Chromeleon7美国Thermo科技公司超声波清洗机SB-5200DTS宁波新芝生物科技股份有限公司电子天平BP211D型sartorius公司色谱柱SupersilODS2（4.6mmｘ250mm，5µm，大连依利特分析仪器有限公司）试剂柚皮苷（批号110737-200415），中国食品药品检定研究院，供含量测定用。乙腈为色谱纯，纯净水（杭州娃哈哈集团公司），其余试剂均为分析纯。中药白矾、法半夏等由安徽济顺中药饮片有限公司中药厂提供。2研究的起因近年来在癫痫的各方面研究都取得了很大的进展。西药主要通过目前新开发的抗癫痫药主要是通过影响离子通道,增加抑制性神经元功能,减弱兴奋性神经元功能而起到抗癫痫作用[3]。目前,中药治疗癫痫的作用机制已经取得了较突出的进展,国内外的专家学者对中药抗癫痫的研究前景都十分看好,如何从现有的研究成果中开发一种广谱、低毒、无副反应的抗癫痫新药,并能应用于临床将成为下一步研究的重点[4]。但中药制剂由于成分复杂、基础研究薄弱、有效成分不明确、作用机制不清楚等原因，其质量控制长期以来成为了中药制剂的难点和关键问题，如何基于中药特点开展中药制剂质量研究一直是业界研究探讨的重要内容[5]。与质量标准相关的基础研究较为薄弱的问题在于，中药大多为复方制剂,化学成分比较复杂,有效成分等基础研究难度较大,进展缓慢；而受基础研究薄弱,对照品提取分离难度较大等因素影响,部分中药质量标准中所选择的检测指标不能完全体现中药的治疗作用[6]。而在国务院发布的关于中医药事业的意见中曾提到，推进实施中药生产质量管理规范，加强中药生产质量监管是十分重要的[7]。因此，要客观面对问题，找出解决的办法，推进中成药质量的整体提升。质量评价要能真实反映中成药的内在质量，方法要科学、可行，并得到国际认可。总之，只要坚持科学理念，本着推进中药发展，为人民服务的精神，中成药的质量会不断得到提高[8]。红白蚕石丸全方由生磁石粉、白矾、炒僵蚕、法半夏、天麻、化橘红6味中药组成，为制订科学合理的提取制备工艺，保证产品质量，采用HPLC法对制剂中柚皮苷的含量进行了测定，为建立其可行、可控的质量标准提供了充分的科学依据。3制剂中各药材的有效成份及作用分析3.1生磁石粉：生磁石是四氧化三铁与氧化铁的混合物，还含有锰、镁、铅、钛等元素，进行了久煅醋淬的炮制后，主要含三氧化二铁及醋酸铁等[9]。有潜阳安神、镇静作用，适用于阴虚阳亢所致的烦躁不宁、睡眠不安，头晕头痛及癫痫之证。3.2白矾：白矾为硫酸盐类矿物明矾石经加工提炼制成，主要成分为含水硫酸铝钾[KAl(SO4)2·12H2O],别名明矾、矾石、理石、白君、雪矾、羽涅、羽泽、云母矾等[10]。白矾有解毒杀虫之功，外用多煅成枯矾，尤能收湿止痒，主要用于痈肿疮毒、湿疹疥癣、口舌生疮、耳内流脓等证。内服多用生白矾，有较强的祛痰作用，用于风痰壅盛，或癫痫等证。3.3炒僵蚕：僵蚕所含的蛋白质有刺激肾上腺皮质的作用，动物实验有抗惊厥作用。现代医学实践研究表明白僵蚕对治疗腮腺炎、癫痫及脑炎后遗症有治疗作用[11]。药用能息风止痉，又可化痰，适用于肝风内动及痰热所致的惊风、癫痫、中风等痉挛抽搐之证[12]。3.4法半夏：本品含挥发油、棕榈酸、植物笛醇、生物碱、粘液质、淀粉、油酸、硬脂酸、亚麻仁油酸等，目前发现半夏中有90个化学成分,定性80个化学成分,分别为生物碱类7个、醇醚类8个、脂肪酸甘油脂类12个、黄酮类5个、溶血磷脂酰胆碱类12个、醇氨类10个、氨基酸类11个、酰胺类11个、其他类型4个化合物[13]。本品能抑制呕吐中枢，有止吐作用；还有祛痰、镇咳、缓解支气管痉挛等作用。能燥湿化痰，为治湿痰、寒痰要药。半夏中有毒成分难溶于水，不易被热所破坏(在100℃的水中三小时也不能完全破坏)，也不能单纯被姜汁所破坏，而能被白矾所消除[14]。3.5天麻：天麻有镇静、抗惊厥、抗癫痫和促进胆汁分泌的作用。本品含生物碱，甙类、香草醇、维生素A、粘液质。其中天麻素属于脂溶性物质，穿透血脑屏障后对抑制兴奋性氨基酸产生与释放有明显的作用，还能降低髓性细胞核分化抗原（MyeloidCellNuclearDifferentiationAntigen,MNDA）受体活性，避免钙离子的升高，进一步阻断N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-asparticAcidReceptor,NMDA）钙离子通路，从而达到抗惊厥的作用[15]。现代以本品配全蝎、僵蚕等药用于“流感”、“乙脑”引起的脑神经刺激症状如痉挛、抽搐等有一定的疗效，如天麻祛风汤。3.6化橘红为橘的外层果皮。辛、苦，温；归肺、脾经。现代研究表明化橘红含有黄酮、多糖、香豆素、挥发油等多种化学成分，具有显著的止咳化痰、抗炎、抗氧化、增强免疫力和防治糖尿病所导致的心肌功能损伤等药理作用[16]。4含量测定4.1方法与结果 4.1.1样品溶液的制备[17]：表2方法供试品溶液的制备取本品，研细，精密称定0.4g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，水浴加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，以0.45µm滤膜滤过，即得。柚皮苷对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品8.8mg于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，其浓度为88mg/ml。精密量取1ml上述对照品溶液于25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液，得浓度为35.2mg/ml.缺化橘红空白液的制备按处方比例，准确称取除化橘红以外的其它药材，模拟本品的制备工艺和供试品的制备方法，制成缺化橘红空白溶液。化橘红药材溶液的制备取化橘红药材0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流1小时，放冷，称定重量，用甲醇补足失重。摇匀，滤过，取续滤液5ml置50ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀既得。4.1.1.1色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸水（20：80）为流动相；检测波长为283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。4.1.1.2最大吸收波长的选择：参考中国药典2015年版一部化橘红项下柚皮苷的高效液相法测定检测波长，确定本测定的检测波长为283nm。2、色谱条件与适用性试验[18]：4.2.1空白干扰试验：取供试液、化橘红对照液、缺化橘红空白液，各进样5μl，在283nm处检测，结果表明柚皮苷对照液和供试品溶液在该波长下均呈现吸收峰，而缺化橘红空白液在与对照品相应的位置上未见色谱峰出现，见图1，表明本测定空白无干扰。ABCA柚皮苷B缺化橘红空白C供试品图1HPLC色谱图4.2.2线性关系考察[19]：配制柚皮苷对照品溶液浓度为70.4μg/ml，分别进样1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积积分值，结果见表3。以柚皮苷的进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果柚皮苷进样量在0.0704~0.4224μg范围内线性关系良好，对所得数据进行回归分析得回归方程：y=2.1696X，r2=0.9997。标准曲线见图2。表3柚皮苷线性关系考察结果进样量（μg）0.07040.14080.21120.28160.35200.4224峰面积（A）1.9134.4456.6728.76110.81712.915图2柚皮苷的标准曲线4.2.3精密度试验[20]：精密吸取对照品溶液5μl，连续进样6次，测定峰面积积分值，计算精密度，结果柚皮苷6次测定的RSD为0.142%，表明精密度良好，见表4。表4精密度试验结果次数123456±SDRSD（%）峰面积（A）5.2425.2505.2605.2535.2535.2635.254±0.007450.1424.2.4稳定性试验[21]：精密吸取供试品溶液5μl，分别在间隔0、3、6、9、12、18、24小时进样，共进样测定7次，其峰面积积分值在测定时间24h内基本不变，供试品柚皮苷7次测定的RSD为0.207%，表明在测定时间24h内稳定性良好，见表5。表5稳定性试验结果时间（h）0369121824±SDRSD（%）峰面积（A）5.6555.6475.6665.6585.6705.6755.6805.664±0.01170.2074.2.5重复性试验表6重复性试验结果次数123456±SDRSD（%）淫羊藿苷（mg/g）2.3612.3842.3612.4122.3012.3472.361±0.03721.584.2.6回收率试验：表7回收率试验结果称样量样品中的量加入量测得量回收率（%）（g）（mg）（mg）（mg）单次平均RSD0.20050.4730.4960.96398.6398.651.750.20040.4730.4960.96498.980.20090.4740.4960.96198.200.20060.4740.4960.970100.070.20020.4730.4960.971100.460.20370.4810.4960.95595.584.2.7样品的测定[18]：分别精密吸取对照品溶液与三批供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪测定，并计算各批样品中柚皮苷的含量，结果见表8。表83批样品含量测定结果批号含量（mg/g）平均含量12（mg/袋）2104072.3612.3842.3732104082.6142.6512.6322104092.6532.7222.688 5.讨论红白蚕石丸全方由生磁石粉、白矾、炒僵蚕、法半夏、天麻、橘红等药材组成，具有熄风镇惊，平肝安神之效，临床主要用于治疗头目眩晕，目胀耳鸣，肢麻震颤，语言不利，步履不稳等证。总结上述实验结果，本课题制定了红白蚕石丸的含量测定研究方法，为有效评价该制剂质量提供了科学依据。柚皮苷具有很高的药用价值，可以用于制备治疗咳嗽和止咳化痰的药物。因其具有良好的诱导成骨作用，因此可以用于治疗骨缺损及骨质疏松，对牙周病也有一定的治疗作用[2]。同时柚皮苷还具有明显的促进胃溃疡愈合，保护心肌细胞等作用[2]，具有较高的药物开发价值。参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:中国医药出版社,2015:318-319.[2]刘影,庞富.化橘红有效成分柚皮苷的研究进展[J].粮食与油脂,2021,34(02):8-10.[3]胡艳丽,周园,杨德林,吴越.抗癫痫新药研究进展[J].农垦医学,2001(06):405-408.[4]李满,郑辑英,李光来.抗癫痫中药作用机制研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2005(11):64-66.[5]阳长明,陈霞,赵巍,韩炜,张永文,李计萍,周思源.基于源头控制的中药制剂质量研究[J].中草药,2021,52(02):321-326.[6]李淼.中药质量标准研究现状[J].黑龙江医药,2014,27(01):135-137.[7]国务院.国务院关于扶持和促进中医药事业发展的若干意见[S].国发[2009]22号,2009.[8]马双成,王翀,朱炯,戴忠.中成药的整体质量状况及有关问题分析[J].中国药学杂志,2019,54(17):1369-1373.[9]朱祥成.耳呜——中医对策[A].中华中医药学会、中华中医药学会耳鼻喉科分会、“世中联”耳鼻喉口腔科专业委员会.中华中医药学会耳鼻喉科分会第15届学术交流会论文集[C].中华中医药学会、中华中医药学会耳鼻喉科分会、“世中联”耳鼻喉口腔科专业委员会:中华中医药学会耳鼻喉科分会,2009:6.[10]马浩文,赵启苗,单国顺,鞠成国,贾天柱.白矾炮制历史沿革及现代研究概况[J].中国现代中药,2021,23(03):562-566.[11]米红霞,刘吉平.白僵蚕应用研究进展[J].广东蚕业,2010,44(01):46-