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文档简介
实验一血糖的斐林法测定
一、实验目的
掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。
二、实验原理
1.血糖指的是血液中哪一种糖?
葡萄糖是血液主要的糖类,因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。
2.用什么方法测定?
测定血液中葡萄糖的含量,即测复杂组分中一种物质的量,根据生化实验基
本技术的原理,可采用分光光度法(比色法)进行测定。
3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗?
不行,可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热,铜离子
即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜,后者又可使铝酸试剂还原成低价的铝蓝
(蓝色)。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比,氧化亚铜的量与形成的铝化合
物的量成正比,可以用比色的方法进行测定。
三、材料、仪器与试剂
(一)、材料:动物血液
(二)、仪器(仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审
定)
分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿
(三)、药品(试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审
定后并配制)
标准葡萄糖溶液、碱性硫酸铜溶液(A、B液)、酸性铝酸盐溶液、10%鸨酸钠溶
液、0.33mol/L硫酸溶液
四、实验操作:
1.无蛋白血滤液的制备
用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml,缓缓放入20ml锥形瓶中,加水7ml,
摇匀,血液变成红色透明时加10%鸨酸钠1ml,摇匀,再加0.33mol/L硫酸,
随加随摇,加完放置5〜15min,至沉淀由鲜红变为暗棕色,滤纸过滤。每毫升
无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。
2.血糖的测定
取具25m1刻度的血糖管3只,编号,用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml,放
入第一只血糖管中,于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中
加2ml蒸储水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液,同时置沸水浴内煮6min,
取出,在流水中迅速冷却,各加入4ml酸性铝酸盐溶液,Imin后以蒸镭水稀释
至25ml,混匀,倒入比色杯,用722型风光光度计于420〜440nm波长比色(先
以空白管调节零点,然后测标准管和样品管)。
五、计算
按下式计算100ml全血中所含的血糖质量(mg)o
m=A1C0
AO/0.1xlOO
式中:m:100ml血中所含的糖质量
CO:标准葡萄糖溶液浓度
Al:样品溶液吸光度
精品
AO:标准溶液吸光度
六、注意事项
1.欲得准确结果,所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太
快,会有大量血液粘在吸管内壁,容量不准,所以一般放出1ml血液所用的时间
不应少于Imino
2.沉淀由鲜红变为暗棕色,是因鸨酸钠与硫酸作用生成鸨酸,在适当酸度时,
使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊,可在鸨
酸与血混合液中加入10%硫酸1〜2滴,待变为喑棕色后再滤。
实验二种子粗脂肪的提取
一、实验目的
脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中,测定脂肪的含量,可以鉴别其品质
的优劣,也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目。
二、实验原理
在了解了实验目的之后,关于这个实验有以下几个问题需要大家思考:
1.种子成分很复杂,脂肪的提取如何进行?
2.什么是粗脂肪?
精品
(答:脂肪不溶于水,易溶于有机溶剂(如石油股)。利用这一特性,选用
有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外,还有游离脂
肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质,故浸提物称粗脂肪。)通过以
上问题的思考,我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具
体的实验操作粗脂肪的提取,一般采用索氏脂肪提取器。
利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂(本实验用
石油酸,沸程为30〜60℃)对样品中的脂类物质进行提取。
图索氏脂肪提取器
1.浸提管2.通气管3.虹吸管4.小烧瓶5.冷凝管
索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的,提取管两侧分别有
虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时,将待测样品包在脱脂
滤纸包内,放入提取管内。提取瓶内加入石油酸,加热提取瓶,石油酸气化,由
连接管上升进入冷凝器,凝成液体滴入提取管内,浸提样品中的脂类物质。待提
取管内石油酸液面达到一定高度,溶有粗脂肪的石油般经虹吸管流入提取瓶。流
精品
入提取瓶内的石油酸继续被加热气化、上升、冷凝,滴入提取管内,如此循环往
复,直到抽提完全为止。
精品
三、材料、仪器与试剂
(一)实验材料
大豆、花生、葭麻、向日葵、芝麻等油料种子。
(二)仪器设备
索氏提取器(50mL),烧杯,干燥器,脱脂滤纸,银子,分析天平,烘箱,
恒温水浴,脱脂棉。
(三)试剂
石油酸(化学纯,沸程30〜60℃)。
四、实验操作
1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在80〜100七烘箱中烘4小时。待冷却后,
准确地称取2〜4g,置于研钵中研磨细,将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉
一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好,勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后,
斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内,最后再用石油酸洗净研钵后倒
入提取管内。
2.洗净索氏提取瓶,在105℃烘箱内烘干至恒重,记录重量。将石油触加
到提取瓶内约为瓶容积的1/2〜2/3。把提取器各部分连接后,接口处不能漏
气。用70〜80℃恒温水浴加热提取瓶,使抽提进行16小时左右,直至抽提
管内的石油懒用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全。
3.提取完毕,取出滤纸包,再回馈一次,洗涤提取管。再继续蒸储,当提
取管中的石油懒液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时,倒出石油醴。若提取瓶中
仍有石油醴,继续蒸储,直至提取瓶中石油醴完全蒸完。取下提取瓶,洗净瓶的
外壁,放入105
精品
℃烘箱中烘干至恒重,记录重量。
五、注意事项
1.本法采用沸点低于60℃的有机溶剂,不能提取出样品中结合状态的脂类,
故此法又称为游离脂类定量测定法。
2彳寺测样品若是液体,应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在60〜80℃烘箱
中烘干后放入提取管内。
3.本法使用有机溶剂石油悔(沸程30〜60℃)故加热时不能用明火。
六、思考题
1.索氏提取法提取的为什么是粗脂肪?
2.做好本实验应注意哪些事项?
精品
实验三氨基酸分离——双向层析法
一、实验目的
学习双向纸层析的原理和操作方法,进行混合氨基酸的分离分析。
二、实验原理
纸层析是以滤纸作支持物,用一定的溶剂系统展开,使混合样品达到分离分
析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再
选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取
出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经
展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值此来表示。
_原点至纸层析斑点中心点的距离
&二原点至溶剂前沿的距离
纸层析可看作是溶质(样品)在固定相与流动相之间的连续抽提,由于溶质
在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系
数,因而在恒定条件(液剂、PH、温度)下,各物质有固定的当值,据此可达
到分析鉴定的目的。
精品
由于滤纸纤维可吸收20〜25%的水分;且其中6〜7%以氢键形式与纤维素上
羟基结合,一般条件下难脱去;所以纸层析实际上是以水相作固定相,展开的溶
剂作流动相。
纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般
用上行法。上行法又分单向(成分较为简单的样品)和双向(单向时斑点重叠分
离不开,于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层)。双相层析谱可分辨十几种
以上的样品。
层析滤纸要求:
(1)质地均匀,平整无折痕,厚薄适当,溶剂能匀速展开。
(2)机械强度好,溶剂展开后能保持原状,不易折到。
(3)有一定纯度而少杂质,以免影响层析图谱背景。
(4)纤维松紧适宜,一般选用中速滤纸,或根据溶剂选择。如丁醇类粘度
大,宜用快速滤纸;而氯仿、石油醴展开快,宜用慢速滤纸。
层析溶剂要求:
(1)被分离物质在该溶剂系统中凡在0Q5〜0.8之间,各组分之七值相差
最好能大于0.05,以免斑点重叠。
(2)溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。
(3)分离物质在溶剂系统中的分配较恒定,不随温度而变化,且易迅速达
到平衡,这样所得斑点较圆整。
本实验采用八种混合氨基酸为样品,用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析,
以苗三酮为显色剂,可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下:
精品
三、材料、仪器与试剂
(-)实验材料
标准氨基酸混合溶液:亮氨酸、缴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门
冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各lOOmg溶于50ml0.01M盐酸中。
(-)仪器设备
层析缸25X40cm(X2);培养皿15cm(X2);喷雾器;毛细管内径0.1cm;
电吹风;烘箱。层析滤纸14Xllcm;铅笔,尺。
(三)试剂
0.1%(W/V)苗三酮溶丙酮液;
溶剂系统:第一相:正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2(V/V);
第二相:正丁醇:口比咤:95%乙醇:水=5:1:1:1(V/V)o
四、实验操作
1.点样
取层析滤纸一张(14Xllcm),在距纸边1.2cm处划一基线;再将纸转90
精品
,距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液,点
与二线交点处(见图4-1),点的直径控制在2mm左右,不可过大。待样品干燥
后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后,把滤纸卷成圆筒形,纸的两边以铭丝相连,
但不可重叠相碰。
2.展层
在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入,
点样一段接触溶剂,以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开,约2
小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸,悬挂于室温中,以电吹风充分吹尽溶
剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘,将滤纸转90。,卷成如前圆筒状,放入
盛第二相溶剂的层析缸内展开(操作同上),约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm
时取出,以电吹风吹尽溶剂使其干燥。
纸层析点样、展层
(X,Y分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离,x为点样原点)
3.显色
精品
以喷雾器将苛三酮均匀地喷在滤纸上,然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分
钟,即可看到紫红色氨基酸斑点,将图谱上的斑点用铅笔圈出。
五、注意事项
(1)烘箱加热温度不可过高,且不可有氨的干扰,否则图谱背景会泛红。
(2)第一相溶剂最好在使用前再按比例混合,否则会引起酯化影响层析效果。
(3)接触滤纸时,要戴手套。
六、思考题:
1.酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响?
2.为什么展层时要用两种溶剂系统?
精品
实验四样品中总氮量的测定—微量凯氏定氮法
一、实验目的
1.掌握凯氏定氮仪的使用方法;
2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。
二、实验原理
1.什么是凯氏定氮法?有什么意义?
大多数蛋白质中氮的含量较恒定,平均为16%,即每100g蛋白质中含16g
氮,因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量(每测得1g氮即相当
于6.25g蛋白质)。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础,即用定氮法测得的样
品含氮量乘以6.25,即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量=含氮量X6.25,
测定蛋白质含量的方法很多,其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的方法。
测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。
2.该方法原理?
蛋白质样品先经浓硫酸加热消化,使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮,然
后经碱化蒸播,放出的氨气用标准酸吸收,再用标准碱来滴定剩余的酸,计算出
的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量。
三、材料、仪器与试剂
(-)实验材料:市售面粉
(二)仪器设备(仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案
后教师审定)
凯氏烧瓶;凯氏定氮蒸镭装置;容量瓶;微量滴定管;烘箱;电炉;1000
精品
毫升蒸镭烧瓶;小玻璃珠或毛细管;电子
精品
天平。
(三)试剂(试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教
师审定后并配制)
浓硫酸(AR);硫酸铜;硫酸钾混;甲基红乙醇;漠甲酚绿乙醇;棚酸;乙
醇;氢氧化钠;
四、实验操作:
1.凯氏定氮仪的构造和安装:
凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器,反应管及冷凝器三部分组成:
蒸汽发生器包括电炉及一个1~2升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应
管相连,反应管上端有一个小漏斗,样品和碱液可由此加入到反应室,反应室中
心有一长玻璃管,与蒸汽发生器相连,下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可
通过反应室上安全管及冷凝器通过吸收瓶中。安装时各连接处不能漏气,且安装
好的不可轻易移动,以免仪器损坏。
2.样品处理:
某一固体样品中的含氮量是用100克该物质(干重)中所含氮的克数来表示
(%)o因此在定氮前,应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都
采用105℃,因为非游离的水,都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量磨细的样品,然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。
用以竭钳将称量瓶放入干燥器内,待降至室温后称量,按上述操作继续烘干样品。
每干燥1小时后,称重一次,直到两次称量数值不变,即达恒重。
若样品为液体(如血清等),可取一定体积样品直接消化测定。
精确称取0.1克左右的干燥面粉作为实验的样品。
精品
3.消化:
取四个100ml凯氏烧瓶并标号。各加1颗玻璃珠,在1及2号瓶中各加样品
0.1克,催化剂200毫克,浓硫酸5毫升,注意加样品时应直接送入瓶底,而不
要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1毫升蒸储水和与1及2号瓶相同
量的催化剂和浓硫酸,作为对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加
完后,将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。
在消化开始时应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分
解并放出SO?白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明淡绿色为止
①。消化完毕,等烧瓶内容物冷却后,加蒸储水10毫升(注意慢加,随加随摇)。
冷却后将瓶中内容物倾入50毫升的容量瓶中,并以蒸储水洗烧瓶数次,将洗液
并入溶量瓶。用水稀释到刻度,混匀备用②。
4.蒸储:
(1)蒸储器的洗涤:在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸储水,加浓硫
酸数滴及毛细管或玻珠若干,关闭甲乙,将蒸汽发生器中的水烧开,让蒸汽通过
整个仪器。并检查有无漏气,5分钟后,打开活塞乙,使蒸汽洗涤漏斗5分钟,
复将乙关闭,继续蒸储约5分钟,然后在冷凝器下端放一个盛有5毫升2%硼酸
溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图,冷凝器下端应完全浸没
在液体中,继续蒸汽洗涤1—2分钟,观察锥形瓶内的溶液是否变色,如不变色
则证明蒸储装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶,使硼酸液面离开冷凝管口约
1厘米,继续通蒸汽1分钟,最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉,由
于蒸汽发生器内蒸气冷缩,压力减低,反应室内的水可自动吸出进入废液管中(图
中3),打开甲,将废液排出。
精品
(2)蒸播:取50毫升锥形瓶数个,各加5毫升硼酸和1—2滴指示剂,溶液
呈紫红色,用表面皿覆盖备用。关掉电炉,打开活塞甲、乙,再将事先准备好的
盛有5m12%硼酸及指示剂的锥形瓶放在冷凝管中下,使管口浸入液面以下。用吸
管取10ml消化液,细心地由小漏斗处注入反应室,用2—3ml蒸储水洗涤小漏斗,
待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加30%NaOH10ml(用
小量筒量取),让NaOH缓缓流入反应室,当小漏斗内仍有少量NaOH时,即关
闭乙,再用约3ml蒸储水于小漏斗内,同样放入反应室,并留少量水在漏斗内作
水封,关闭乙,立即加热蒸汽发生器,并使沸腾,开始蒸储。待三角烧瓶中液体
由紫红色变成蓝绿色时再继续蒸镭3分钟,将三角烧瓶下降,使冷凝管口离开液
面约1cm,继续蒸1分钟,用少量蒸镭水冲洗冷凝管下口,洗液直接流入锥开瓶
内,然后,先移去锥形瓶,关掉电炉,使反应室内废液倒吸进入废液管内,打开
甲而放出。整个蒸储装置立即洗涤(包括水洗及蒸汽洗)备用。待样品和空白消
化液均蒸镭完毕后,同时进行滴定。
(3)滴定:全部蒸馈完毕后,用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量,
硼酸指示溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。
五、结果与讨论:
1.计算:
转一―明一匕)x0.014x100消化液总量(加)
心站’已W测定时消化液用量(ml)°
C:标准盐酸溶液摩尔浓度。
V.:滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。
V2:滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。
W:样品重量(克)。
精品
14:氮的原子量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质,则样品中蛋白质含量(%)=总氮量义
6.25,若样品中除有蛋白质外,尚有其它含氮物质,则需向样品中加入三氯乙酸,
然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量,得出非
蛋白氮及总氮量,从而教育处出蛋白氮,再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮一非蛋白氮
蛋白质含量(克%)=蛋白氮X6.25
六、思考题
1.写出实验中应注意的主要事项。
2.指出该法测定蛋白质含量的局限性。
3.指出其它测定蛋白质含量的方法。
精品
实验五蛋白质的性质实验一蛋白质及氨基酸的
呈色反应
一、实验目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
双缩服反应
二、实验原理
尿素加热至180℃左右,生成双缩胭并放出一分子氨。双缩服在碱性环境中
能与G?+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩胭反应。蛋白质分子中有肽键,
其结构与双缩服相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩胭反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个一cs
—NH2,—CH2—NH2,—CRH—NH2,—CH,—NH2—CHNH2—CH2OH或一
CHOHC&NH?等基团
NH2NH2
II
的物质以及乙二酰二胺(O=c——C=O)等物质也有此反应。NH.3也干扰此反
2+
应,因为NH,与C/可生成喑蓝色的络离子Cu(NH,)40因此,一切蛋白质
或二肽以上的多肽都有双缩股反应,但有双缩版反应的物质不一定都是蛋白质或
多肽。
三、材料、仪器与试剂
尿素;10%氢氧化钠溶液;1%硫酸铜溶液;2%卵清蛋白溶液
四、实验操作
取少量尿素结晶,放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素
开始硬化时,停止加热,尿素放出氨,形成双缩胭。冷后,加10%氢氧化钠溶液
约1ml,振荡混匀,再加1%硫酸铜溶液1滴,再振荡。观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜,否则,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再加
1%硫酸铜溶液2滴,随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。
甫三酮反应
精品
二、实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和苗三酮反应产生黄色物质外,所有a—氨基酸及一切
蛋白质都能和苛三酮反应生成蓝紫色物质。
B一丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮毗峰和肽
键上的亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质和氨基酸均有苛三酮反应,但能
与玮三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严
防干扰物存在。
该反应十分灵敏,1:1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种
常用的氨基酸定量测定方法。
苛三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2,NHs和醛,水合
的三酮被还原成还原型玮三酮;第二步是所形成的还原型苗三酮同另一个水合苗
三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5-7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的
颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。
三、材料、仪器与试剂
蛋白质溶液;2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1:9);0.5%甘氨
酸溶液;01%苗三酮水溶液;01%苗三酮-乙醇溶液
四、实验操作
①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加0.5ml0.1%Wf
三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1〜2分钟,观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴0.1%
苗三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。
黄色反应
二、实验原理
含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物
质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝酿酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,
需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
三、材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液;大豆提取液;头发;指甲;0.5%苯酚溶液;浓硝酸;0.3%色氨
酸溶液;0.3%酪氨酸溶液;10%氢氧化钠溶液
四、实验操作
向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢
可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶
液至碱性,观察颜色变化。
精品
管号1234567
鸡蛋清大豆0.5%0.3%0.3%
材料指甲头发
溶液提取液苯酚色氨酸酪氨酸
(滴)少许少许
44444
浓硝酸/
244040444
(滴)
现象
考马斯亮蓝反应
二、实验原理
考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中,其以游离态存
在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它染色灵敏度高,比氨基黑高3倍。反应速度快,约在2分钟左右时间达到
平衡,在室温一小时内稳定。在SOI〜LOmg蛋白质范围内,蛋白质浓度A595nm值
成正比。所以常用来测定蛋白质含量。
三、材料、仪器与试剂
蛋白质溶液(鸡蛋清:水=1:20);考马斯亮蓝染液
四、实验操作
取2支试管,按下表操作
考马斯亮蓝染
蛋白质溶液蒸播水
液
管节(ml)(ml)
(ml)
1015
20.10.95
五、思考题
1.苗三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?并说明原因。
精品
2.你能区分蛋白质苗三酮反应及其他氨基化合物苛三酮反应的结果吗?试
解释之。
3.能否利用苛三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在?
4.哪些芳香基因(蛋白质中的、非蛋白质中的)可以与浓硝酸作用呈现黄
色反应的阳性结果?
实验六蛋白质的性质实验一一蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水
胶体颗粒,在一定的理化因素影响下,蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
(1)可逆的沉淀的反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化,除去
引起沉淀的因素后,蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中,并保持其天然性质
而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用
于蛋白质。提纯蛋白质时,常利用此类反应。
(2)不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变,蛋白质常
变性而沉淀,不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固,蛋白质与重
金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
精品
蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷),并不析
出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、材料、仪器与试剂
(-)实验材料:鸡蛋清
(二)仪器设备:试管
(三)试剂
PH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲溶液;3%硝酸银溶液;5%三氯乙酸溶液;95%乙
醇;饱和硫酸镀溶液;硫酸锡结晶粉末;0.1mol•匚'盐酸溶液;0.1mol•I?氢
氧化钠溶液;0.05mol•L」碳酸钠溶液;0.1mol•L」醋酸溶液;甲基红溶液;2%
氯化钢溶液
四、实验操作
1.蛋白质的盐析:无机盐(硫酸筱、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出
蛋白质。盐的浓度不同,析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸镀溶液中析出,而清蛋白则在饱和硫酸镀溶液中才
能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀,当降低其盐类浓度时,又能再溶解,故蛋白质的
盐析作用是可逆过程。
加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中,再加等量的饱和硫酸镀溶液,混匀后静
置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀,加少量水,观察是否溶解,
为什么?将管中内容物过滤,向滤液中添加硫酸镀粉末到不再溶解为止,此时析
出的沉淀为清蛋白。
精品
取出部分清蛋白,加少量蒸储水,观察沉淀的再溶解。
2.重金属离子沉淀蛋白质:重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管,加入蛋白质溶液2ml,再加3%硝酸银溶液1〜2滴,振荡试管,
有沉淀产生。放置片刻,倾去上清液,向沉淀中加入少量的水,沉淀是否溶解?
为什么?
3.某些有机酸沉淀蛋白质:取1支试管,加入蛋白质溶液2ml,再加1ml5%
三氯乙酸溶液,振荡试管,观察沉淀的生成。放置片刻,倾出上清液,向沉淀中
加入少量水,观察沉淀是否溶解。
4.有机溶剂沉淀蛋白质:取1支试管,加入2ml蛋白质溶液,再加入2ml95%
乙醇。混匀,观察沉淀的生成。
5.乙醇引起的变性与沉淀:取3支试管,编号。依下表顺序加入试剂:
\试剂(ml)
0.1
0.1
5%卵清mol•L-1pH4.7
管号、mol•L195%乙
蛋白溶氢氧化缓冲溶
盐酸溶醇
液钠液
溶液
11————11
211——1一
31——11一
振摇混匀后,观察各管有何变化。放置片刻,向各管内加水8ml,然后在第
2、3号管中各加一滴甲基红,再分别用
精品
0.1mol•L」醋酸溶液及0.05mol-L-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变
化和沉淀的生成。每管再加0」mol•L」盐酸溶液数滴,观察沉淀的再溶解。解
释各管发生的全部现象。
五、思考题
1鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂?
2.氯化汞为何能做为杀菌剂?
精品
实验七血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的
学习酸酸纤维薄膜电泳的操作技术,了解电泳技术的基本原理,测定人血清
中各种蛋白质的相对含量。
二、实验原理
醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电
泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于
有机溶剂(如:丙酮,氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成
为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构,渗透性强,对分子移动阻力小,
厚度为120/zmo
醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点:①电泳后区带界限清晰;②
通电时间较短(二十分钟至一小时);③它对各种蛋白质(包括血清白蛋白,溶
菌酶及核糖核酸酶)都几乎完全不吸附,因此无拖尾现象;④对染料也没有吸附,
因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很
均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低,因此必需在密
闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发。
本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物,分离人血清蛋白。血清蛋白中含有
清蛋白、。一球蛋白、夕一球蛋白、了一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质
由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同(见下表),在电场中
的迁移速度不同。分子量小、等电点低的,在相同碱性PH缓冲体系中,带负电
荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中
电泳,染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快,其余依次是
精品
a1-,%—/—,/—球蛋白(如图1)°
醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖
蛋白,甲胎蛋白,类固醇及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺
凝胶电泳低,但它具有简单,快速等优点。根据样品理化性质,从提高电泳速度
和分辨力出发选择缓冲液的种类,pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发
性强,对显色或紫外光等观察区带没有影响,若样品含盐量较高时,宜采用含盐
缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液;氨基酸
的分离则可选用PH7.2的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽
度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号,点上样品,在一定的电压,电流下
电泳一定时间,取下滤膜,进行染色。不同物质需采用不同的显色方法,如核昔
酸等物质可在紫外分析灯下观察定位,但许多物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下,溶于一定的溶剂中进行光密度测
定。也可以浸于折射率为1474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用光
密度计测定。它的缺点是厚度小,样品用量很小,不适于制备。将血清样品点样
于醋纤膜上,在pH8.6的缓冲液中电泳时,血清蛋白质均带负电荷移向正极。由
于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等,加之分子大小和形状各
异,因而电泳迁移率不同,彼此得以分离。电泳后,CAM经染色和漂洗,可清
晰呈现清蛋白、
精品
a2.(3、Y一球蛋白5条区带,比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百
分数。
人血清中5种蛋白质的等电点及分子量
蛋白质名称等电点(pl)分子量
清蛋白4.886900
a一球蛋白5.06%〜200000
%〜300000
90000-150000
夕一球蛋白5.12
156000-300000
球蛋白6.85〜7.50
三、材料、仪器与试剂
(―•)、材料:人血清
(二)、仪器
醋酸纤维薄膜(8X2mm);点样器;染色皿,漂洗器,镣子;玻璃板;常压电
泳仪;直流电源整流器;水平电泳槽;粗滤纸;直尺和铅笔
(三)、药品
巴比妥缓冲液(pH8.61=0.06);氨基黑10B染色液;漂洗液;95%乙醇45ml、
冰醋酸5ml;蒸储水50ml;洗脱液0.4mol/LnaOH;透明液;无水乙醇:
冰醋酸=7:3
四、操作步骤
1、仪器与薄膜的准备
(1)醋酸纤维薄膜的选择与润湿
用镣子取一片薄膜,在距醋纤膜一端L5cm用铅笔作好标记,然后将薄膜放
精品
进缓冲液中,小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在15〜30
秒内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此薄膜均匀可以用于电泳;若薄膜润
湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹或斑点,则表示薄膜不均匀应弃去,以免影响电
泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟,当完全浸透后,用镣子轻轻取出,夹在两
层滤纸内吸干,方可用于电泳。
精品
(2)电泳槽的准备(如下图)
将电泳槽置于水平平台上,将缓冲液注入电泳槽中,两边的电极槽缓冲液的
高度要
在同一平面。根据电泳槽支架的宽度,裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个
膜支架上,各放2〜4层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电
极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气
泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥
梁,故称为滤纸桥。
将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下,点样前应在滤纸上反复练习,
此步是实验的关键,掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重
要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后,用镜子轻轻取出,夹在两层滤纸内
吸干,平铺在玻璃板上(无光泽面朝上),再在膜条一端2〜3厘米处轻轻水平
落下并随即提起,使血清完全深透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。
精品
3、电泳
用镣子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上,点样面朝下,另一
端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行,则图谱不整。膜条与滤纸桥
之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距1〜
3mm,使之不互相接触,以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电,否则分
离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极,开启电源通电。电压160V,电
流强度0.4—0.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。
4、染色
电泳完毕后断电,用镜子取出薄膜条投入染液5〜10分钟,染色过程中不时
轻轻晃动染色皿,使染色充分。
5、漂洗
从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液,投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂
洗,直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带,待干。
6、透明
将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2〜3分钟后取出平铺在玻
璃板上用一直径0.5cm的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有气泡。干燥
后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。
7、定量
(1)洗脱比色法
精品
将各蛋白质区带仔细剪下,分置各试管中,另从空白背景剪块平均大小的膜
条置于空白管中。各管加入0.4moi/!NaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡),
待颜色脱净即用波长620nm比色,以空白管调零,读各管吸光度。计算:
吸光度总和⑴=4+4.+A°2++A,(吸光度)
血清蛋白组分的相对百分数:正常值
清蛋白%=A./TX100%54%〜73%
g球蛋白%=Affl/TX100%2.78%〜5.1%
a?球蛋白%=Aa2/TX100%6.3%〜10.6%
0球蛋白%=&%/TX100%5.2%〜11%
〜
Y球蛋白%=AZ%/TX100%12.5%20%
(2)光吸收扫描法
将染色干燥的血清蛋白醋纤维素薄膜电泳图谱放入自动光吸收扫描仪(或色
谱扫描仪)内,未透明的薄膜通过反射,透明的薄膜通过透射方式进行扫描。在
记录仪上自动绘出各组分的曲线图:横坐标为膜的长度,纵坐标为光吸收值;每
个峰代表一种蛋白组分,下图为扫描模式图。同时可进行数据处理,以打字的方
式显示各组分的相对百分含量。目前,临床检验多采用此法从处理数据。
精品
实验八酶的特性
一、实验目的
酶是生物催化剂,生物体内化学反应基本上都是在酶的催化下进行的。通过
本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响,
对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、内容
本实验由温度对酶活力的影响,;PH对酶活力的影响;酶的激活剂及抑制剂;
酶的专一性4组实验组成。
(一)酶的专一性
1、实验原理
酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异(专一)性,即一
种酶只能对一种底物或一类底物(此类底物在结构上通常具有相同的化学键)
起催化作用,对其他底物无催化反应。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉
和蔗糖的作用为例,来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖无还原性,唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性二糖的麦芽糖,
精品
但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能蔗糖水解产生还原性单糖葡萄糖和果糖,
但能催化淀粉的水解。用
精品
Benedict试剂检查糖的还原性。Benedict试剂为碱性硫酸铜,能氧化具还
原性的单糖,生成砖红色沉淀氧化亚铜。
2、材料、仪器与试剂(仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报
告中提出方案后教师审定)
⑴材料:新鲜配制稀释200倍的新鲜唾液;
⑵仪器:恒温水浴;沸水浴;试管及试管架;
(3)试剂:2%蔗糖溶液;溶于0.3%NaCl的1%淀粉溶液;蔗糖酶溶液;Be
nedict试剂o
3、实验操作
⑴淀粉酶的专一性
精品
表1淀粉酶专一性加样顺序
管号123456
1%淀粉溶液(滴)4—4—4—
2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4
唾液稀释唾液(ml)——11—
煮沸过的稀释唾液(ml)————11
蒸储水(ml)11————
37℃恒温水浴中保温5分钟
Benedict氏试剂(ml)111111
沸水浴2〜3分钟
(2)蔗糖酶的专一性
表2蔗糖酶专一性加样顺序
管号123456
1%淀粉溶液(滴)4—4—4—
2%蔗糖溶液(滴)—4—4—4
蔗糖酶溶液(ml)——11一
煮沸过的蔗糖酶溶液(ml)————11
蒸储水(ml)11————
37℃恒温水浴中保赤.5分钟
Benedict氏试剂(ml)111111
沸水浴2〜3分钟
(二)温度对酶活力的影响
1、实验原理
酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下,酶的反应速度最高。大多数
动物酶的最适温度为37-40℃,植物酶的最适温度为50-60℃o
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂,虽加热到10
0℃,其活性并无明显的改变,但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低酶或抑制酶的活性,但不能使酶失活。
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色,糊精按其分子的大小,遇碘可呈蓝色、紫色、
暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色,麦芽糖遇碘也不呈色,在不同温度
下,淀粉被唾液淀粉酶水的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
精品
2、材料、仪器与试剂(仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报
告中提出方案后教师审定)
(1)材料:新鲜配制稀释200倍的新鲜唾液;
(2)仪器:试管及试管架;恒温水浴;冰浴;沸水浴;
(3)试剂:0.2%淀粉;0.3%NaCl溶液;KI—12碘溶液;
3、实验操作
取3支干燥的试管,编号后按下表加入试剂:
表3温度对酶活力影响实验加样顺序
管号123
淀粉溶液(ml)1.51.51.5
稀释唾液(ml)11
煮沸过的稀释唾液(ml)1
摇匀后,将1、3号试管放入37℃恒温水浴中,2号试管放入冰水中。10
分钟后取出(将2号内液体分两半),用KI—L溶液来检验1、2、3号管内淀
粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放
入37℃水浴中继续保温10分钟后,再用KI—L液实验,记录实验结果。
(三)PH对酶活力的影响
1、实验原理
酶的活力受环境PH值的影响极为显著。不同酶的最适PH不同。本实验
观察PH对唾液淀粉酶活性的影响。唾液淀粉酶的最适PH约为6.8o
2、材料、仪器与试剂(仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报
告中提出方案后教师审定)
精品
(1)材料:新配制的溶于0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液
(2)仪器:试管及试管架;吸管;滴管;锥形瓶;恒温水浴
(3)试剂:0.2MNazHPO,溶液;0.1M柠檬酸溶液;KIT2碘溶液;P
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