青霉素的生产工艺流程-夏德虎

湖北生物科技职业学院生物药物的一般生产工艺主讲人：夏德虎团队人员：符小珍、邓红美知识目标：掌握ß-内酰胺类抗生素的理化性质掌握发酵生产青霉素的条件控制，及青霉素提取与精制的控制点。能力目标：通过实训，熟悉工业生产青霉素的工艺流程并熟悉根本操作重点:掌握发酵生产青霉素的工艺流程难点:青霉素提取与精制的控制点什么是青霉素青霉素又被称为青霉素G、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，能破坏细菌的细胞壁〔革兰氏阳性菌〕并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素是β-内酰胺类抗生素的典型代表。青霉素结构ß-内酰胺类抗生素是分子中含有ß-内酰胺环的一类天然和半合成抗生素的总称。青霉素的开展历程1939年

弗洛里和钱恩提取了青霉素的晶体1928年

弗莱明发现了青霉菌1941年

证实了青霉素对链球

菌、白喉杆菌等多种

细菌感染的疗效

1953年5月

中国第一批国产青

霉素诞生，揭开了中

国生产抗生素的历史。作用机制细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、平安的抗细菌感染药物临床应用〔1〕临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。〔2〕各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素，头孢菌素母核。青霉素的理化性质1、稳定性固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大的关系；2、溶解度青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其钾盐、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇3、降解反响：青霉素是很不稳定的化合物，遇酸碱或加热易分解而失去活性，并发生分子重排。4、紫外吸收5、过敏反响青霉素生产菌的生物学特性：产黄青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。青霉素发酵工艺1.发酵工艺流程〔a〕最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，不能满足工业生产要求，所以被淘汰。现在主要采用的的产黄青霉菌。〔b〕为了提高产黄青霉的青霉素产量使用的诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。〔1〕菌种：〔2〕孢子制备将沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度25~26ºC，培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，制得斜面孢子。再移植到优质小米或大米固体培养基上，25ºC，相对湿度45%-50%，生长7天，制得小米孢子。孢子成熟后进行真空枯燥，低温保存备用。种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油消沫剂等；接种量:>200亿孢子/t培养基空气流量:1：3〔m3/m3·min〕；搅拌转速:300-350r/min；pH:自然；温度：27±1℃；时间:40h。二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等；接种量：10％；空气流量：1:1-1.5〔m3/m3·min〕；搅拌转速：250-280r/min；pH：自然；温度：25±1℃；时间：10-14h；生产罐培养工艺三级罐：生产罐；培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.温度控制适宜菌丝生长温度一般为27ºC，分泌青霉素20℃20℃青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降温控制22℃pH控制合成适宜pH6.4－6.6左右，防止超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质〔硫酸铵、油脂〕恒速补糖，用酸或碱控制方式根据pH补糖溶氧控制＜30％饱和度，产率急剧下降；＜10％，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30％。通气比：1：0.8－1.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧各阶段的供氧比较菌丝生长速度与形态、浓度发酵稳定期，湿菌浓度可达15%~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。在发酵中后期一般每天放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。前期:主间歇搅拌,少加油中期:搅拌、加油、稍微降低通气量〔必要时〕策略：少量屡次。后期:尽量少加消沫剂青霉素的发酵过程控制十分精密，一般2小时取样一次，测定发酵液的ＰＨ、菌浓、残糖、青霉素效价等指标，同样取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后ＰＨ波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。提炼工艺过程１．青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活２．水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定３．易溶于有机溶剂，水中溶解度很小４．青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性５．防止降解，条件温和、快速。预处理青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：10－30Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大局部杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的别离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白过滤鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节，参加0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取〔收率90％〕溶剂萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：2－3次。逆流萃取过程正相萃取：酸化，滤液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式离心机别离〔浓缩〕反相萃取：〔磷酸盐、碳酸盐缓冲液〕。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取2－3次，到达结晶要求。萃取条件：10℃下。萃取罐冷冻盐水冷却。脱色1.萃取液中添加活性炭，除去色素。2.过滤，除去活性炭。结晶——直接结晶加醋酸钠－乙醇溶液反响：得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液：得到青霉素钾盐。薄膜蒸发工艺图结晶——共沸蒸馏结晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取下得到