动物细菌常见主要耐药基因检测技术

3动物细菌常见主要耐药基因检测技术本文件规定了动物细菌常见主要耐药基因的PCR检测技术要求。本文件适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行动物细菌四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类及氯霉素类主要常见耐药基因的检测及gyrA、gyrB、parC和parE基因的突变分析。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部农医发〔2017〕25号病死及病害动物无害化处理技术规范GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求SN/T2025-2016动物检疫实验室生物安全操作规范SN/T3640-2013出口食品中致泻大肠杆菌检测方法PCR法SN/T2206.12-2014化妆品微生物检验方法第12部分：绿脓杆菌PCR法。兽医实验室生物安全技术管理规范中华人民共和国农业部公告第302号（《兽医实验室生物安全技术管理规范》）3术语和定义本文没有需要界定的术语或定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（basepair）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DNase：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TE缓冲液：TE缓冲液（Tris-EDTAbuffersolution）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）5原理4根据动物细菌tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（aac（3）-IV、aacC4、sul1、sul2、dfrA1、cmlA和cat1等常见的主要耐药基因序列设计特异性引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。6仪器和器材6.1高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000r/min）6.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-70℃±1℃冰箱。6.3PCR扩增仪6.5凝胶成像系统6.6微波炉6.7分析天平6.8离心管：15mL离心管、1.5mL离心管和0.2mLPCR专用离心管。6.9微量可调移液器：1000μL，200μL，100μL，50μL，20μL，10μL，2μL。7试剂和引物注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。7.1DNA抽提试剂：DNAzol®Reagent，外观为淡绿色，于4～8℃保存。7.2无水乙醇：-20℃预冷。7.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。7.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。7.5dNTP（2.5mmol/L）。7.6阴性对照：灭菌双蒸水。7.7阳性对照：动物细菌耐药菌株。7.8无菌生理盐水。7.9TE缓冲液（pH8.0）。7.10TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。7.11溴化乙锭。7.12DL2000DNAMarker。用于PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列及扩增产物大小见附录A。8操作步骤8.1菌悬液制备挑选37℃培养18～24h后的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。8.2DNA提取58.2.1DNA的提取按照DNAzol®Reagent提取试剂说明书进行，并设立阳性对照、阴性对照。8.2.2将800μLDNAzol加入1.5mL灭菌离心管中，然后分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200μL，颠倒混匀后，4℃12000r/min离心10min。8.2.3然后吸取900μL上清液转移至加入新的1.5mL灭菌离心管中，再加入500μL无水乙醇混匀，4℃12000r/min离心5min。8.2.4弃上清，加入1mL75%乙醇，4℃12000r/min离心5min。重复洗2次。8.2.54000r/min离心10s，用微量移液器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10min。8.2.6加入20μLTE缓冲液或经高压处理的灭菌双蒸水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70℃冰箱。可以采用其他等效DNA提取方法或合法化商品化DNA提取试剂盒进行操作。8.3PCR检测8.3.1PCR反应体系建立25μL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：——灭菌蒸馏水17.375μL——10×PCRBuffer2.5μL——2.5mmol/LdNTP2μL——ExTaqDNA聚合酶0.125μL——上游特异性PCR引物0.5μL——下游特异性PCR引物0.5μL——DNA模板2μL8.3.2PCR反应条件94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度根据引物进行选择（51℃、53℃、4℃保存反应产物。将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）板点样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。9试验成立条件与结果判定9.1试验成立条件9.1.1阴性对照阴性对照未出现特异性扩增条带。9.1.2阳性对照9.1.2.1tet（A）基因阳性对照出现577bp的扩增条带。9.1.2.2tet（B）基因阳性对照出现634bp的扩增条带。9.1.2.3tet（C）基因阳性对照出现223bp的扩增条带。9.1.2.4tet（M）基因阳性对照出现594bp的扩增条带。9.1.2.5gyrA基因阳性对照出现566bp的扩增条带。9.1.2.6gyrB基因阳性对照出现1116bp的扩增条带。69.1.2.7parC基因阳性对照出现334bp的扩增条带。9.1.2.8parE基因阳性对照出现488bp的扩增条带。9.1.2.9aac（6′）-Ib-cr基因阳性对照出现485bp的扩增条带。9.1.2.10aac（3）-IV基因阳性对照出现286bp的扩增条带。9.1.2.11aacC4基因阳性对照出现726bp的扩增条带。9.1.2.12sul1基因阳性对照出现822bp的扩增条带。9.1.2.13sul2基因阳性对照出现273bp的扩增条带。9.1.2.14dfrA1基因阳性对照出现367bp的扩增条带。9.1.2.15cmlA基因阳性对照出现698bp的扩增条带。9.1.2.16cat1基因阳性对照出现547bp的扩增条带。当在同一次实验中同时符合以上条件时实验成立，否则实验无效，需重新进行。9.2结果判定在紫外凝胶成像仪下观察结果，实验成立时，如果被检菌株出现预期大小的扩增条带，则可初步判断被检菌株携带相应的耐药基因，初步判断为阳性结果的菌株可通过核酸序列测定进行确认及耐药基因（gyrA、gyrB、parC、parE）的突变分析。如果被检菌株未出现预期大小的扩增条带，则可判断被检菌株未携带相应的耐药基因。10检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2-2004的规定执行。11废弃物处理按照GB19489-2008的规定执行。附录B（规范性附录）附录C引物动物细菌常见耐药基因的PCR引物℃tet（A）F5’-GGTTCACTCGAACGACGTCA-3’R5’-CTGTCCGACAAGTTGCATGA-3’tet（B）F5’-CCTCAGCTTCTCAACGCtet（C）F5’-TCAAGCCTTCGTCACTR5’-AAGCTGTCCCTGATGGTCGT-3’tet（M）F5’-GAGGTCCGTCTGAACR5’-AGAAAGGATTTGGCGaac（3）-IVR5’-TCATCTCGTTCTCCGparCR5’-TCGCTCAATAGCAGCTCG-3’parEF5’-TACCGAGCTGTTCCTgyrAR5’-ACTTCCGTCAGGTTGTGC-3’gyrBR5’-CGTCACGCTGCGGAATGT-3’Aac（6′R5’-CGAATGCCTGGCGTGTTT-3’aacC4F5’-GCTCATCGGTCAGCTF5’-CCGCCACGGTGTTGTTGR5’-CACCTTGCCTGCCCATCATTAG-3’F5’-CCGTCTCGCTCGACAR5’-CAAGGCGGTTGCGTTTGA-3’F5’-TTCGGCATTCTGAATR5’-ATGATCTAACCCTCGGTCTC-3’F5’-GGAGTGCCAAAGGTGAR5’-GAGGCGAAGTCTTGGGTF5’-AGTTGCTCAATGTACCTR5’-TTGTAATTCATTAAGCAT9附录E（规范性附录）附录F试剂配制F.1电泳缓冲液（50倍）F.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水F.1.2TAE（三羟甲基氨基甲烷一乙酸）电泳缓冲液（50倍）80mL调pH至8.0加至100mL羟基甲基氨基甲烷（Tris分析纯）冰乙酸0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)灭菌双蒸水用时用灭菌双蒸水稀释使用。24257.1加至1000gmLmLmLF.2TE缓冲液（pH8.0）F.2.11mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液取12.11gTris置于100mL烧杯中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解，冷却至室温后，用浓盐酸调pH值至8.0，定容至100mL，121℃高压15min，室温保存。F.2.210倍TEBuffer取10mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液和0.5mol/L