铁诱导alpha突触核蛋白聚集机制研究

铁诱导alpha．突触核蛋白聚集的机制研摘要帕金森病disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾以肌强直铁诱导alpha．突触核蛋白聚集的机制研摘要帕金森病disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。其主要病理nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神经元的缺失和细胞内体(LewybodesLBs)51DFenton反应形成羟自由基(hydroxylradical，OH·)，而Fe3+则可以通过Haber-循环还原成Fe2+进而生成OH·。OH·酸的细胞膜，最终导致细胞死亡。目前已有大量证据表R珥alpha一突触核蛋白在PD发病机制中起到重要的作用。Alpha成并对细胞产生毒性。神经病理学研究发现以alpha．突触核蛋白异常聚集为主要病一定联系。另有实验证实Fe2+署llFe3+可在体外及细胞内促进alpha-突触核蛋白的聚集region，UTR)发现最近，人们在alpha-突触核蛋白的5’端未翻译区 核蛋白聚集的机制，本实验应用甲基噻唑基四唑(methyl法，流式细胞术cytometry，FCM)，硫磺素S和荧光双标记，逆转链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)5'-UTR类的质粒alpha．synuclein—IRE．Luc，应用双荧光素酶检测实铁可以通过铁调节核蛋白的表达。结果如下regulatoryproteins，IRPs)．IRE系统调节alpha．突1、1Fe2+和Fe3+处理SK-N．SH细胞24h，细胞存活率下降物质 species，ROS)生成增加，与对照组相比差别有统计学意恹细胞内alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多2、5lamol／LVE与mmol／LFe2+或mmol／LFe3+共孵育SK—N．SH细胞24h可以2、5lamol／LVE与mmol／LFe2+或mmol／LFe3+共孵育SK—N．SH细胞24h可以断细胞内alpha．突触核蛋白聚集，提示氧化应激部分参与了铁诱导的alpha3、成功构建了携带alpha一突触核蛋白IRE．Lue荧光素酶报告载体，应用双荧光素酶检测系统在HEK293mRNA5'-UTR的Ferroportinl-IRE-Luc荧光素酶报告载体作为阳性对4、mmol／LFe3+孵育HEK293细胞可使alpha．synuclein．IRE．Luc转染组荧光素表达上调，与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<O．05)；100}tmol／Lmesylate，DFO)孵育HEK293细胞则alpha-synuclein．IRE．Luc转IRE具有铁反应性5、IRPl的干涉载体pSilencerl．0．U6．IRPI与荧光素酶报告载体学意义(P<0．05)；而IRPI的高表达载体pCMV6一AC—AC01与alpha-synuclein．IRE．Luc共转染HEK293细胞增加细胞内IRPl表达后则alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增上述实验结果表明：细胞内铁水平可以通过氧化应激途径诱导SK．N．SH细胞alpha-突触核蛋白聚集体的形成，VE完全阻断氧化应激后并未完全缓解alpha．突核蛋白的聚集，提示氧化应激仅部分参与了铁诱导alphaalpha—synuclein—IRE．Luc荧光素酶报告载体的转录受细胞内铁水平和IRPl聚集，继而导致聚集，继而导致DA能细胞的损伤和死亡。本研究将为铁和alpha指导教师：谢俊disorder progressiveasymptomaticallybylossofdopaminergicneuronsinthesubstantiacharacterizedbyinintracellularinclusionsknownasandthepresenceofalpha-synucleinbodies(LBs)．TheincidenceofPDis1．7％inthepeopleoverinChina．Alongwith overwhelmingoftheeffertsusedinthe pathogenesisarenotfullytodayaimstoalleviatethesymptoms．Itisofgreatimportancedisorder progressiveasymptomaticallybylossofdopaminergicneuronsinthesubstantiacharacterizedbyinintracellularinclusionsknownasandthepresenceofalpha-synucleinbodies(LBs)．TheincidenceofPDis1．7％inthepeopleoverinChina．Alongwith overwhelmingoftheeffertsusedinthe pathogenesisarenotfullytodayaimstoalleviatethesymptoms．ItisofgreatimportanceunderlyingneurodegenerationinPD．tostudingtheIronplaysacrucialinPDpathogenesis．Excessivefreeiron，especiallyferrouscouldgeneratehydroxylFentonreducedtoferrousironbyHaber-Weisscycle．Thedamageandacids，whichfinallyoftherolepathosenesis．Hi曲inalpha-theoftheaggregatesduetoadecreasealpha-synucleinproneto andincreaseforrateassociatedwitllstudiesshowedlinkbetweenironandalpha-synuclein．Ithaswhichisconsistentafoundconcentrationofferrousandferricironpromotealpha- andinvitro．Recentlyapredicatedironresponsivediscoveredintheregion(UTR)ofalpha- awhichironcausethedeaththeup—regulatingalpha-synucleinexpression．Toiron-alpha-synucleinaggregation，3一(4，5·dimethylthiazol-2一yi)一2，5-bromide(M网Simmunofluorencestaining,reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT—thealpha—westerninpresentoxidativestressaggregationwereobservediniron··treatedSK-N·-cellstoinvestigatethebetweenoxidativecontainedalpha—assayswhetherluciferaseIREisafunctionalelementinHEK293cells．ThenweconfirminSK-N-ironregulatoryresults ironorferricirontreatment241．1reducedinSK-N-SHneuroblastomatocontr01)，andalpha-synucleinaggragateswereobservedto2．Pretreatmentwithfullyblocktheandreductionpartiallyalleviated．Thereasultsindicatedalpha-synucleinaggregationcouldonlycontributestoiron—-oxidativeironorferricirontreatment241．1reducedinSK-N-SHneuroblastomatocontr01)，andalpha-synucleinaggragateswereobservedto2．Pretreatmentwithfullyblocktheandreductionpartiallyalleviated．Thereasultsindicatedalpha-synucleinaggregationcouldonlycontributestoiron—-oxidativealpha··synucleinconstructedreporteralpha—synuclein-IRE— dualluciferaseassaywasappliedinHEK293cellstodetectthefunctionoftheIREpost-·transcriptionalregulation；Ferroportinl·-IRE··Lucwastobethepositive4．24hafterbypRL-pGL3vectors(pGL3-theratiowerealpha-withlmmol／Lironlalpha．．synuclein．．IRE．．Lucproducedconsistentlyactivitygroup(P<0．05)，whileinDFOtreatedthatofthepredicatedIl也iSirondetected(尸<0．05)，indicatingwithmixtureinratio5．Cellswere1：20：80(pRL-pSilencerlMl．O—U6- alpha-synuclein一Ⅱi正一luciferaseofthecontrolgroup俨comparedconsistentlypCMV6．AC．ACOlgroups，lOWerluciferaseactivitywasdetected俨<0．05)．ThewasmediatedbvintracellularIRP1indicatedthatiron．dependentcellsweretransfected6．SK-pSilencerntincellswithP1knockdwonUP-regulatedTheabovethatironcouldalpha-synucleinaggregationcells．asindicatedbytheresultsthroughoxidativestressinblockedandoxidativeincells．Inregulatoryalpha-synucleinTheabovethatironcouldalpha-synucleinaggregationcells．asindicatedbytheresultsthroughoxidativestressinblockedandoxidativeincells．Inregulatoryalpha-synucleinitonofIREintheII冲alterations．indicat酣5’-UTRalpha—functional．andcouldregulatealpha-synucleinevidencethatthepredicatedIREinthe5’-U豫ofalpha．synucleinOurfindingscausethedeathafunctionalelement．Ironbyalpha—synuclein aggregationthroughIRE／IRPsystemandoxidativeevidencetotheinteractionofironpresentstudyalpha—synucleininPDandprovidesanewtagetfortherapiticalapproachesofSupervisor：JunxiaKeywords：Parkinson’Sdisease；alpha-synuclein；iron；vitamin引引言帕金森病disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，以黑nigra，SN)多巴引引言帕金森病disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，以黑nigra，SN)多巴胺(dopamine，DA)能神经元慢性变性坏死和路易小体(Lewybodies，LBs)形成为病理特征Ⅲ。随着人类社会老龄化的发病人数也逐年上升，在我国，65岁以上人群的发病率已到达1．7静止性震颤、肌僵直、运动减少为主要临床表现，另外还包括协同运动减少活动启动困难，姿势反射丧失，流涎，面具脸等症状，整个病程呈进行性加重PD患者DA能神经元死亡的病因和确切机制尚不清楚，目前认为环境和遗传因素在D的发生、发展中起共同作用。由于目前D的发病机制尚未明了，尚无防治此病的有效方法。因此进一步了解DA能神经元变性死亡的关键机制成为攻克PD核心问题Alpha．突触核蛋白是198810，极易受外界环境影响形成聚集体，如高温，低PH值，杀虫剂，金属离子n1LBs痴呆、多系统萎缩，阿尔茨海默病和PD等多种神经退行性疾病，这种以形态学标志，因此N致密部神经细胞体内的ah-突触核蛋白异常聚集是D态学特征，而alpha．突触核蛋白基因的A53T，A30P和E46K的点突变可导致家族遗传性PD睁121。据此推测alpha-突触核蛋白聚集可能是散发性PD中心环节，了解细胞内的alpa-突触核蛋白聚集的机制对于理解PD的致病过程具有重要意义研究表明，铁在PD的发病中是一个关键因素。临床尸检结果、动物模型等都供了越来越多的线索。经颅超声研究观察到PD患者SN铁水平增高早于的出现，在6一羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和1．甲基4一苯基6．四氢吡啶(1methy4．henyl．1，2，3，6．etahydropyridie，MPTP)制备的经典PD模型中也都发现了铁含量的增加32¨。A由单胺氧化酶O．)诱发的氧化脱胺及自身氧化生成黑色素的过程中都能产生H202乜副，在细胞内铁水平存在的情况下，尤其是在Fd+过多的情况下，通过Fenton反应瞳∞和Habe-Weiss循环Ⅲ1使H202转换成·，导致氧化应激状态，最终造成A能神经元的损伤。神经病理学研青岛人学硕Ij学位论Fe3+可以青岛人学硕Ij学位论Fe3+可以增快alpha．突触核蛋白单体在溶液内的聚集啡，2引，高浓度的Fe2+可诱导过达A53T突变alpha-突触核蛋白的DA能神经元细胞内alpha，突触核蛋白聚集的形啪3。但是铁诱导alpha．突触核蛋白聚集的机制尚不清楚氧化应激是诱导alpha一突触核蛋白聚集的重要途径之一㈣，DA的氧化代谢物多巴醌可通过形成多巴胺．alpha．突触核蛋白聚合物增强alpha．突触核蛋白聚集体的稳定性，使alpha．突触核蛋白聚集停留在有细胞毒性的寡聚体状态，从而导致PD择性的多巴胺能神经元变性。驯。铁是否可以通过氧化应激诱导a．突触核蛋白的聚集并损伤DA能神经元有待进一步证实。此外，最近的研究发现在编码140个氨基酸的alpha．突触核蛋白的mRNA的5’端未翻译区的46个碱基对可形成一个环，这个结构与H．erritin的IRE结构极为相似，且与编码L．erritin，feroportn，红细胞系5．氨基酮戊酸合成酶(erythrod5．minoevlinate，ALS)和线粒体顺乌头酸酶的5'-UTR区的IRE也很相似。而突触核蛋白家族的bata．突触核蛋白、gama．突触核蛋白、ortin1等没有这个类RE口羽。铁调节蛋白(ironregulatoryproteins，IRPs)可与IRE特异性结合，当细胞内铁水平升高时，IRP$降解或活性降低∞3·训，使5'-区含有IRE的mRNA表达上调汹瑚1。这一推论为铁可能通过IRE／IRP系统调节突触核蛋白的表达从而导致DA能神经元的死亡提供了依本实验旨在阐明铁与alpha．突触核蛋白聚集之间的关系，通过证实alpha-突触蛋白5'-UTR区的类IRE是功能性元件，阐明铁不仅可以通过氧化诱导alpha．突触核蛋白聚集，还可通过IRE／IRP系统转录后调节alpha．突触核蛋白表达，使alphaDAP2材料和方1．细胞培1．1常用试胎牛血清(FetalSerum，FBS)：Biochromag公司产品D．hank’s液：Hyclone公司产青材料和方1．细胞培1．1常用试胎牛血清(FetalSerum，FBS)：Biochromag公司产品D．hank’s液：Hyclone公司产青霉素、链霉素：新华制药厂产品1．2常用仪颗粒制冰机：Sanyo公司，日本1．3常用液体配DMEM培差基DMEM粉l袋(GibcoCat12500．039)溶于1000ml蒸馏水，加入gmol／L的HCl或NaOH调节pH至7．2，用孔径为灭菌，分装为89ml／瓶，4℃保存备用ltm的过滤器ml，Gibco)过细丝墙差旦Q：Q!堕Q!丝磋酸盐缓泣遮(￡垦曼NaCl8．0g、KClg，Na2HP04·12H203．49g，KH2P040．2g，用蒸馏水定容至1000壹』壁垩塞篮在遮青霉素80万U溶于 PBS，链霉素100万U溶于PBS，各取到均为l万U／ml的溶液，滤菌后分装为mY管，于．20℃保存备用曼K：丛：墨H绁照揸DEMEml，胎牛血清10ml，青／链霉素溶液1ml混匀丛蛋用D．Hank’S液配成0．25％的溶液，过滤除菌，．20℃保存1．4细胞培养步3后，用培养液悬浮，然后接种于培养瓶中，置于37。C，％C022×104cm2接种于培养板或玻片上。2．1常用试硫酸亚铁(ferrousammoniumFAC)、VE、MTT、DMSO．-Sigma异丙后，用培养液悬浮，然后接种于培养瓶中，置于37。C，％C022×104cm2接种于培养板或玻片上。2．1常用试硫酸亚铁(ferrousammoniumFAC)、VE、MTT、DMSO．-Sigma异丙醇：北京化学试剂公司产品2．2常用仪酶标仪(R．T．2100C)：雷杜公司，中国称取M丌5mg，溶于0．01mol／LPBS得mg／mlMTT溶液，0．22肛m微孔滤助溶DMSO，室温保存筮酸亚筮渣将浓度为1mmol／L，现用现配E将FAC溶于ddH20，储存液浓度为10mmol／ml，用无血清培养液稀释为工1mmol／ml2．4MTTMTT是一种四甲基偶氮唑盐，在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下，被还取对数生长期的SK-N．SH细胞，胰酶消化后吹打制成单细胞悬液后离心4材料和方细胞数量为lXl04个，置于37。C、5％C02培养箱中培养24h后加入不同稀释度的(0．1、0．3、l、3mmol／L)或Fe3+(1、3、10、30mmol／L)，或VE(1、2、5、Fe3+共孵育细胞24h。阴性对照组以新鲜配制的DMEM与37℃、5％C02培养箱中连续培养24h培养结束前4h，每孔加入mg／ml的MTT20pl，37"C培养箱中培养清后每材料和方细胞数量为lXl04个，置于37。C、5％C02培养箱中培养24h后加入不同稀释度的(0．1、0．3、l、3mmol／L)或Fe3+(1、3、10、30mmol／L)，或VE(1、2、5、Fe3+共孵育细胞24h。阴性对照组以新鲜配制的DMEM与37℃、5％C02培养箱中连续培养24h培养结束前4h，每孔加入mg／ml的MTT20pl，37"C培养箱中培养清后每孑LJ；ll入 BI，自动酶标读数仪比色(主波长494姗，次波长均值／阴性对照组吸光度均值x1003．12,7．二氢二氯荧光黄双乙(2’7’-diacetate，H2DCF-DA)：Sigma公司3．2流式细胞仪(flowcytometry，FCM)：BDBiosciences3．3常用液体的配H_H_2DCF-DA(逊取mgH2DCF—DA溶于ml的HEPES缓冲液H星￡亘墨垩煎盐渣邃(丛亚笪垒坠堡盟亟逝i壁垒丛垦墨20mmol／LHEPES，150mmol／LNaCl，用NaOH调节pH=7．2，用孔径为0．22pm的滤器(1000ml，Gibco)过滤灭菌，分装为500ml／瓶，4筮酸垩迭渣将mg硫酸亚铁，溶于1“的pH值在5．5—6．0之间的DMEM无血清培内，终浓度为lmmol／L，现用现配巡度lmmol／ml。3．45青岛人学硕lj学位论ml。h青岛人学硕lj学位论ml。hJ下常对照组：无血清培养液处理24铁蛋白)或FAC(1mmol／L，pH=6．0，不含VE／Fe2+组：VE(2、5、10I_tmol／L)与硫酸亚铁VE／Fe”组：VE(E、5、10gmol／L)与FAC(1mmol／L)共孵育243．5FCM检测ROS原理及方H2DCFDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细可以知道细胞内活性氧的水平测定ROS：药物处理结束，消化细胞并计数，每个样本取lxl06个细胞；每个本加入H2DCF-DA(终浓度为5gmol／L)1ml，细胞中浓度为lxl06个／ml，37。C避光载30min；用HEPES缓冲液洗3次后；每样本加入1目钢丝网过滤；将样品加入流式细胞仪的样品室，以激发波长488nnl，发射波长nmNFC／SSC10000个细胞，CELLQuestPrDFC的荧光强度阳，巩蚓。4．荧光双标检测alpha．突触核蛋白聚4．1常用试硫磺素S，LB509抗体：Sigma4．2常用仪4．3液体配硫磺素称取硫磺素54％垒聚甲醛6材料和方4g的多聚甲醛，O．8g的氯化钠，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸馏水中，置于60。C001mol／Lml的 g溶于NaCl-2．125吕KCh馏水中70％材料和方4g的多聚甲醛，O．8g的氯化钠，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸馏水中，置于60。C001mol／Lml的 g溶于NaCl-2．125吕KCh馏水中70％甘油300lxlO．01mol／L的PBS加入700山的甘油硫酸亚铁溶将度为1mmol／L，里缱将FAC溶于ddH20，储存液浓度为100mmol／ml，用无血清培养液稀释为工度mmol／ml4．4细胞接种与药物处h后分组处理细胞，Fe2+组／Ve3+组：无血清培养液作用24h，硫酸亚铁铁蛋白)或FAC．(1mmol／L)24mmol／L，pH=6．0vE／Fe3+组：VE(2、5、10gmol／L)与FAC(1mmol／L)共孵育244．5操作步SK-N．SH细胞种植于24孔板中，孔中预先放置高压处理的盖玻片进行免疫光标记实验。吸出培养液，用30min。固定后的培养细胞用0．01mol／LPBS洗3次，0．1％TritonX．100室温处理min，用PBS洗涤一次后正常山羊血清37"C孵育lh。吸出封闭液，直接加入7突触核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育过夜(16h以上)；用PBS洗涤次；加入Rhodamine标记的羊抗兔的二抗的混合液，37℃孵育30rain；用PBSmin×3次：0．05％硫磺素S避光孵育8min；80％乙醇洗涤5minx3；蒸馏水洗涤55．荧光素酶报突触核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育过夜(16h以上)；用PBS洗涤次；加入Rhodamine标记的羊抗兔的二抗的混合液，37℃孵育30rain；用PBSmin×3次：0．05％硫磺素S避光孵育8min；80％乙醇洗涤5minx3；蒸馏水洗涤55．荧光素酶报告载体的构双荧光素酶报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试实验条件变化所干扰本实验为研究alpha．突触核蛋白mRNA上的类IRE是否是功能性元件，需5．1常用试ligase：美国NewEnglandBiolabs公司产品限制性内切酶III、I：日本TaKaRaBioGroup公司产QIAquickkit：德国Qiagen公司产品Endo．freePlasmidMiniI：PromegaLipofectamineTM2000转染试剂盒：美国invitrogen公司产枸橼酸钠均为国产试剂5．2常用仪二氧化碳培养箱：美国Thennoelectron振荡培养箱和照相装置等均为国产仪5．3液体配材料和厦拉握邀缓泣速50mmol／L葡萄搪Tris-高压灭菌后保NaOH渣邃5mol／L乙酸钾60ml、冰乙酸11．5材料和厦拉握邀缓泣速50mmol／L葡萄搪Tris-高压灭菌后保NaOH渣邃5mol／L乙酸钾60ml、冰乙酸11．5ml、28．8m1!SSml去离子水中加入胰蛋白胨(Bacto—Trypton)1g，酵母提取物(Yeast—O．5g，NaClO．5g，聚乙二醇(PEG4000)10g，二甲基亚砜(DMSO)5MgCl25ml，调pH值至6．5，加去离子水定容存!Q竖土三煊基筮酸铀(墨鳗i婴!鱼Q亟盟Y!§翊墼曼，墨Q墨2渲g高纯度的SDS溶于68。C、约80ml的去离子水，滴加浓盐酸调节pH值至将溶液定容至100ml后，室10mmol／L"Iris．C1，lEDTA，调PH值至8．0，高压灭菌，4"C旦丛△鱼速缓泣速(§Q圣坠垦缓独邃ml，用去离子水定容242g、冰乙酸1000ml，室温保存，使用时50倍稀释丕盒旦丛△酶的趔△酶渣速将胰RNA酶溶于10mmol／L"Iris—HCI(pH7．5)和15mmol／LNaCI溶液中，其浓为10mg／ml，加热至100。C15rain，使其缓慢冷却至室温，分装，．20"C冻存L旦速馇擅差胰蛋白胨g、细菌酵母提取物ml，用10g，NaCl10g，加蒸馏水至NaOH调pH至7．O，高压灭菌，4"CL垦固馇墙菱9青岛人学硕lj学位论胰蛋白胨g，酵母提取物5 g，细菌培青岛人学硕lj学位论胰蛋白胨g，酵母提取物5 g，细菌培养用琼脂15g，加蒸馏水至ml，用mol／LNaOH调pH至7．0，高压灭菌，4℃保存氢苄壹霉用生理盐水配制mg／ml储存液，过滤除菌，．20。C保存备用，工作液浓度100I_tg／ml载体pRL-TK(图1)可在哺乳动物细胞中，组成型地表达海洋腔肠荧光素可同萤火虫荧光素酶载体组合作为报告基因活力的内对照。而载体pGL3(图测基因表达。我们采用pGL3作为载体，插入片段则选取含有类IRE的序图pRL-TK载体的环形图。附加描述：内含子的位置，Rluc，编码RenillacDNA，Ampr,在E．coli中编码氨苄抗性，ori，在E．coli中质粒复制起始区。Rluc和Ampr基中的箭头表示转录的方材料和方5图2pGL3载体的环形图。附加描述：luc+，编码firefly荧光素酶的cDNA，Ampr，在材料和方5图2pGL3载体的环形图。附加描述：luc+，编码firefly荧光素酶的cDNA，Ampr，在中编码氨苄抗性，硎，在E．coli中质粒复制起始区。Luc+和Ampr向插入序列如NM00034-alpha-gcgacgcggaagtgaggtgc3'-ccagaaggggcccaagagagggggcgagCgcagcgcagaccccctccgagagcgtcctgggcgctccctcacgccttgccttcaagccttaaaggaattcattagcccc一accctcgtgagcggagaactgggagtggcattcgacgac1．—3'-tagctttccaacttcagctacagtgttagctaagtttggaaagaagacataaagaagaccggg舀tgctgtgcttatagccgtgcctttgccRacetgtgaagaagcccctgggcaagagcagctaaagctactagcatccgaacaaacaaggggagagc舀ct本实验运用化学合成法，由上海生物工程有限公司合成目的基因并连pMDl8．T．alpha．synuclein．IRE、pMDl8一T—ferroportinl-IRE和载体pGL3分别用I和HindIII双酶切，反应体系如下性核酸内切酶1、HindⅢ和NcoI双110丛i煎l各无菌补至轻敲管壁混匀上述液体，37"0水浴h。用1．5％琼脂糖凝胶电泳分离酶10丛i煎l各无菌补至轻敲管壁混匀上述液体，37"0水浴h。用1．5％琼脂糖凝胶电泳分离酶切片5待DNA完全消化后(电泳显示单一条带)，回收纯化按照QIAquickPCRDNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好胶体不超过400mg，加入3倍体积之QGbuffer(即每100mg胶体加入300mlQGbuffer)5012水浴10rain，期间可每隔2～3rainsolution，静置(5)将QIAquickspincolumn置于2ml收集管中，加入上一步的column之最大容量为800m，若样品min，13，000rpm离心积超过800山，则需分次加入)column置回原离心管中，加入mlrpm离心1min，弃掉收集管中液体，将min复rpm离心(8)将spincolumn置于另一个干净的1．5mI离心管中，加入l肚15“lEBbuffer到silicamembrane上，静置minrpm离心column，洗脱DNAmin，丢弃5．6将目的基因与线性化的pGL3线性载1目的基因片1将上述各种试剂加至0．5ml离心管中混匀，16℃过夜反5．7连接产物的转应用TSS线性载1目的基因片1将上述各种试剂加至0．5ml离心管中混匀，16℃过夜反5．7连接产物的转应用TSS两步法，将上述连接产物(重组质粒)转化新鲜制备的09感受态细菌在氨苄霉素(浓度50gg／m1)LB平板上培养立空质粒转化对照和阴性对照JMl09)。具体转化步骤如JMl09菌种，以三区划线法接种于LB固体培(1)取．20℃或．80℃下保存的基，37℃倒置培养过夜12．16h。自LB平板挑取单个新鲜E．coliJMl09LB液体培养基，37℃200r／min振荡培养16～18h3(2)l：100稀释活化菌液，37℃，200r／rain振荡培养h(3)冰浴15min后取1m1菌液至ml离心管中r／min离心rain(4)弃上清，细菌沉淀用(5)加入连接产物，轻轻混匀，冰浴min。(勿振(6)42℃热水浴90SO；，然后冰浴secr／min振摇minlal预温至37℃的LB液体培养基(8)取100gl转化菌，用无菌L棒均匀涂于琼脂平板(含氨苄霉素50gg／m1)质粒小提IIll含氨苄霉素的ALB培养液中，37。(1)挑取上述平板上转化的单个菌落接种至剧烈振荡培养h左右，至OD600约为O．5(2)取1．5ml培养物于1．5ml离心管中，4℃，12000r／min离心2min，弃上r／rain离心lmin，弃上清(3)加入预置4℃的TE缓冲液100“L，重悬菌液加100gl预冷的溶液I，混匀，4"C放置5～10min加200gl新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管数次混匀内容物(不要振荡)，冰浴5min。(6)加 青岛人学硕Ij学位论r／min离心5min(7)加入等体积的(约450清转移至新管；加等体积的冷无水乙醇，充分混匀，．20℃放置h。4"C，12000青岛人学硕Ij学位论r／min离心5min(7)加入等体积的(约450清转移至新管；加等体积的冷无水乙醇，充分混匀，．20℃放置h。4"C，12000离心10min，弃上清，倒置离心管使上清尽可能流尽。加心吸弃上清，倒置离心管使液体流尽，自然干燥10minplTE溶解沉淀，JJl：IRNase(20l咀g／m1)，37。C消化30min。酚、氯仿抽提TE溶解沉淀，．20℃保存备用除Hi迪l!!塑盟鲤!塑醴切将上述提取的质粒DNA行HindlII和NcoI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定否为重组质粒，并将重组质粒分别命名为alpha-synuclein—IRE-LucFerroportin-IRE—酶切鉴定体系如l22质IIII和各无菌将重组质粒阳性的克隆送往上海生工生物工程技术有限公司进行DNA定，检测连接序列是否正确。测序结果与合成序列进行比对，取正确克隆保存菌(甘油终浓度为155．9质粒的大量提按照质粒提取试剂盒E．z．N．A．Endo．freePlasmid骤如下l说明书进行操作，ALB培养液中，37℃剧烈(1)从阳性克隆的菌液中蘸取少量接种至12．16l疵右g／min离心min(2)取ml菌液于15ml离心管中，室温下(3)加250肛l预冷的solutionI／RNase(4)加250材料和g／rain离心10rain，将上清转移至新的(6)室温下mlEppendorf'管中(7)加入0．1体积的ETRsolution，颠倒混匀7。10次，冰上孵育minmin(9)将上述水相转移至新的Eppendo艚中，加入0．5匀6．7次，室温孵育1．2min，注意不要吸到底部ETRsolution，材料和g／rain离心10rain，将上清转移至新的(6)室温下mlEppendorf'管中(7)加入0．1体积的ETRsolution，颠倒混匀7。10次，冰上孵育minmin(9)将上述水相转移至新的Eppendo艚中，加入0．5匀6．7次，室温孵育1．2min，注意不要吸到底部ETRsolution，DNAcolumn并置于2ml收集管上，1(10)将上述所有液体column之最大容量为min(此lal，若样品体积超过800rtl，则g／min离心分次加入)HBcolumn置回原收集管中，用500后10000g／rain离心lmin，此步骤保证去除蛋白质污(12)弃掉收集管中液体，加入700plDNAwashbuffer，10000g／min离心加入一次700斗lDNAwashbuffer，1g／min离心1mincolumn中残留的乙g／min离心(14)将ElutionBuffer，静置1min后g／min离心min后l0000g／min离心1min。离心管内即ElutionBuffer，静置提纯后的重组质粒，．20℃保存备用，用于下一步的定量和转染5．10蛋白质和DNA向细胞内转运的载体。细胞摄取脂质体包装的质粒DNA的能力比包装的DNA高100倍。其优点是操作简单、毒性低和包装容量大。转染步骤按Lipofectamine刑2000使用说明书进行操作，具体操作如下(1)以lxl05个细胞／ml将HEK293细胞接种12无抗生素DMEM培养液，待细胞密度达到(2)取2肛1lipotamineTM2000溶于50p1的无血清无抗生素DMEMO．4pg的质粒溶于501al的无血清无抗生素DMEM培养液，轻轻混匀后，室温静止将两者充分混匀，室温静止(5)37℃孵箱孵育h，换成常规的HEK293细胞培养液，分别作用相应的青岛人学颂I：学位6．双荧光素酶报告系统6．1常用试6．2常用仪M2多功能酶标仪：美国MolecularDevices青岛人学颂I：学位6．双荧光素酶报告系统6．1常用试6．2常用仪M2多功能酶标仪：美国MolecularDevicesC02培养箱：美国Corporation公司倒置显微镜：日本OLYMPUS公司6．3液体配将l体积的lysisbuffer与4体积蒸馏水混合均匀后4"C保存<1个月将substance冻干粉重悬于l buffer里，．20"C储存1个月，．70℃储存1 将0．2ml50xStop＆Glosubstance溶于10mlStop&Globuffer，涡旋10秒1×Stop&Gloreagent，一20。C储存15巡将DFO溶于DMEM无血清培养液内，终浓度为100|lmol／L，现E将FAC溶于ddH20，储存液浓度为10mmol／ml，用无血清培养液稀释为工作浓度mmol／ml6．4实验分1、阴性对照组：PRL-TK／PGL3．control／pSilencerTMl．0．U6一IRPl以l：20：80比例共转染HEK293细胞242、目的基因组：PRL-TK／alpha-synuclein-IRE．Luc／pSilencoml．0．U6一IRPl以3、阳性对照组：PRL．TK／Ferroportin—IRE—Luc／pSilenc矗蹦1．0．U6．IRPl以80的比例共转染HEK293细胞材料和方IRPl高表达l、阴性对照组：PRL．TK／PGL3．control／pCMV6．AC．AC01以l：20：80共材料和方IRPl高表达l、阴性对照组：PRL．TK／PGL3．control／pCMV6．AC．AC01以l：20：80共转染HEK293细胞2、目的基因组：PRL-TK／alpha-synuclein．IRE—Luc／pCMV6．AC．AC01以80的比例共转染HEK293细胞24的比例共转染HEK293细胞24铁孵h后，加入1mmol／L枸橼酸铁胺孵育242、目的基因组：PRL．TK／alpha—synuclein．IRE．Luc以1：20的比例共转染细胞24h后，加入1mmol／L枸橼酸铁胺孵育细胞24h后，加入lmmol／L枸橼酸铁胺孵育24去铁胺孵2、目的基因组：PRL．TK／alpha-synuclein—IRE—Luc以1：20的比例共转染细胞24h后，加入100pmol／L去铁胺孵育24细胞24h后，加入100I．tmol／L去铁胺孵育24h6．5操作步培养细胞，弃掉培养液，用lxPBS冲洗l遍，弃掉每孔加入250pLlxPLB，室温下轻摇晃培养板15min，将溶解液移入新的测试管中96孔板，每孔加入20pLPLB溶解液，加入100肛LL恹II荧光强度(4)加入100laLStop＆Gloreagent，检测海肾荧光素酶荧光强度；注：(1)、分别用不同的注射器加入L恹II和Stop＆Glo(2)、检测时使用112see延迟，读数时间设为7．逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)(reversetranscriptionpolymerase青岛人学硕lj学位论为检测alpha．突触核蛋白mRNA是否受IRE／IRP系统的调控，我们用青岛人学硕lj学位论为检测alpha．突触核蛋白mRNA是否受IRE／IRP系统的调控，我们用核蛋白的表达变化。7．1常用试TRIzol试剂：Invitrogen公司产品TaqDNA聚合酶，dNTP，DNAmarker-Takara电泳缓冲体系Tris，EDTA、硼酸、溴酚蓝：Solarbio公司产品7．2常用仪PCR仪：美国Thermo公司可调式微量移液器：德国Eppendorf公司电泳仪、水平电泳槽：美国Bio．Rad电子天平BS．200S型：德国Sartorius公司DEPC7筮1mlDEPC溶于 ddH20中，搅拌过夜，使DEPC充分溶解，定容至高压灭菌，室温保存2§竖乙醒ml无RNA酶污染的乙醇与 DEPC水充分混匀，．20℃冰箱储存备用主Q圣I△星渣渣(卫HL，室温保存g，冰醋酸ml，EDTA·2Nag，ddH20定容至"Iris—base7．4细胞接种与转细胞接种于6孔板内，待细胞贴壁后，用无血清无抗生素的DMEM培养液细胞，待细胞密度达到90％1对，用lipotamine刑2000转染pSilencerl．0U6．IRPI作h。具体步骤如(1)以lxl05个细胞／ml细胞接种24孔板，待细胞贴壁后，换用无血清无抗生DMEM培养液，待细胞密度达到(2)取5pllipotamineTM2000溶于125pl的无血清无抗生素DMEM培养液中，同时取1¨g的质粒溶于125pl的无血清h。具体步骤如(1)以lxl05个细胞／ml细胞接种24孔板，待细胞贴壁后，换用无血清无抗生DMEM培养液，待细胞密度达到(2)取5pllipotamineTM2000溶于125pl的无血清无抗生素DMEM培养液中，同时取1¨g的质粒溶于125pl的无血清无抗生素DMEM培养液，轻轻混匀后，室温静5(3)将两者充分混匀，室温静置RNA的提取及逆转录(1)转染结束后，吸尽培养液，加入1mlRNA提取试剂TRIzol吹打混匀后转入处理过的Eppendorf管中，室温静置minmin小心吸取上层水相(注意：切勿吸取中『自J层以防DNA的EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后室温静置10rainmin沉淀RNA(5)4℃，12000g离心(6)弃上清，加75％乙醇ml漂洗RNA沉淀min，弃上清，将沉淀物(RNA)自然干燥(8)适量DEPC水溶解RNA后取l肛RNA，用DEPC水稀释至100山，分光光度测定RNA样品的OD260和002so值，以观察所提取的RNA标本的纯度，并计算含量，OD260／OD280在1．8-2．0之间，表明无蛋白质污逆转录反应体系2AMV0．5RNAase0．51肛DEPC补至2042。C反应1h，99℃加热5rain，然后快速冷却到0*C，逆转录得到的cDNA作PCR反应7．6PCR42。C反应1h，99℃加热5rain，然后快速冷却到0*C，逆转录得到的cDNA作PCR反应7．6PCRMullis于1983PCR是一种体外扩增特异性的DNA链的技术，是由明的。可以将一种特异性的核酸序列，以PCR酶类处理后产生成千上万条扩增链因此可以对小量的基因样品进行分析。理论上认为，PCR每一循环包括三个阶段组成：样本DNA解链，使目的基因的两种链得以分开后为退火，以使特异性的单链核苷酸引物得以与目的DNA连接；最后为延伸DNA多聚酶作用使合成链自引物处延伸。因此一个循环的PCR可使目的DNAPC物(inter-primer)。用外引物进行PCR反应后得到的产物再利用内引PCR反应。这种方法既可以提高从低拷贝基因或低丰度mRNA获得目的基率，也有助于提高反应的特异性核蛋白NM00034)序列用Primer5．0软件设计，引物由上海生工生物工程公司合成，序列分别鱼笸旦丛互I G．I’CA’I’GA-PCR扩增条件为：94℃594℃3062℃3072。Csee，共30△!业垒：塞魅璧蛋自里lPCR扩增条件为：94℃594℃30 62℃3072"C45sec，共30循环；72℃延伸10rain。扩增产物片段长度为：244￡￡B厦廑佳丕材料和方8．细胞内alpha．突触核蛋白蛋白表达材料和方8．细胞内alpha．突触核蛋白蛋白表达变化的8．1免疫印8．1．1Tris—base、苯甲基磺酰胺(phenylmethylsulfonylfulride，PMSF)、N，N’一亚甲双丙品N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)：美国公司产品ECL化学发光试剂盒：密理博公司考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒、NaCl、MgCl2、甘油为北京化学试剂公司8．1．2bioscience公司8．1．3二荭公司产品，滴13-actin抗体为Sigma公司产品，滴度：1：8000一=亟anti-8．1．3二荭公司产品，滴13-actin抗体为Sigma公司产品，滴度：1：8000一=亟anti-8．1．4常用液体的ml异丙醇中，储存液浓度为100mmol／L，保存于-20*(2细胞裂解液50mmol／L"IrispH7．5，150mmol／LNaCl，1％Nonidet40，O．5％脱氧胆酸钠(避1mmol／LEDTA，10mmol／LPMSF，PH7．5，过滤后4"C避光保存。临用时取987加入10pl100mM的PMSF，1plpepstatin(1lxg／m1)，1}llaprotinin(1I．tg／m1)，lI．tg／m1)g丙烯酰胺和1gN，N’·亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为37"(2溶解之，补水至终体积ml，pH<7．0，过滤后4"C避光保存gAPS加10gSDS溶于80ml蒸馏水，加热溶解后定容至100ml，室温保!：量堕Q丛!型墨：￡!(卫H墨：墨Tris溶于mlml蒸馏水，用浓HCI调节pH值至8．8，定容至gQ：§匹Q丛!!区墨：￡!(卫H鱼：墨mlg"Iris溶于ml蒸馏水，用浓HCI调节pH值至6．8，定容至!Q兰电速缓泣材料和方Tris30g，甘氨酸144g，SDS10g，ddH20定容至1000ml，调节pH值至8．3!Q兰鳢蹙缓独遮mlTrisg，甘氨酸144g，ddH20定容至材料和方Tris30g，甘氨酸144g，SDS10g，ddH20定容至1000ml，调节pH值至8．3!Q兰鳢蹙缓独遮mlTrisg，甘氨酸144g，ddH20定容至!兰整腿缓泣邃10x转膜缓冲液100ml，甲醇200 ml，调节pH值至8选题缓擅29．22gNaCl，28．87ml冰醋酸，定容至1000mliQ兰至垦S!ml，Tween-24．280g，SDSg，1．0MHCl10ml，ddH20耋呈逝蹇堇(曼QQ堡箜墨适坠巫!!i垒垡垒!坠曼≥鎏鱼甲醇45 ml，冰乙酸10ml，考马斯亮蓝0．25g避鱼甲醇ml，冰乙酸10ml封闭用10xTBST配制5％脱脂奶粉8．1．5细胞接种与HEK293细胞以2x104／ml接种于六孔板内中，当细胞密度达到80％SKNSH2x104ml接种于六孔板内中，当细胞密度达到808．1．6细胞处理好后，用预冷的PBS洗三次，每孑L：JII入30rain，4℃，12000g离心20rain，将上清转移到新的EP管中。用Brandford定蛋白含量，具体步骤如青岛人学硕f：学位pl加到600pl考马斯亮青岛人学硕f：学位pl加到600pl考马斯亮稀释好的样本pl加到600pl考马斯亮蓝工作液内。选分光光度计的的蛋白量将蛋白按每份IIg分装，并用生理盐水调至相同的体积，加入混匀，用沸水煮沸5min，．80℃冰箱冻存8．1．7十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS．PAGE)操作步v，样品前沿开始进入分离胶后，恒压120V(1)将蛋白上样后，浓缩胶恒压(2)将分离好的蛋白质从凝胶转移至PDVF膜，恒压min(IRPI)；恒流mA，30min(alpha．突触核蛋白(3)抗原抗体反应：转膜后，用TBST缓冲液漂洗PDVF膜5minx3次，用5％牛．TBST封闭液在摇床上震摇2hIgG，1：10000)室温震摇2h，TBST缓冲液漂洗(5)an-抗次(6)显色：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，以ml／cm2的量于PDVF膜的蛋白面，室温孵育minrain，显影，定(7)暗室中去除A、B混合液，压片，曝光(8)洗脱缓冲液15minx2次，TBST缓冲液5minxl次，加入目的蛋白的抗体强度的比值表示目的蛋白的表达水平8．2荧光双8．2．1常用试硫磺素S，LB509抗体：Sigma8．2．2激光共聚焦扫描显微镜：日本Olympus公司(IX．818．2．3材料利硫磺素称取硫磺素0．01％的PBS中配成O．5％的贮存液4。C冰箱保存5mg溶于稀释10倍即可材料利硫磺素称取硫磺素0．01％的PBS中配成O．5％的贮存液4。C冰箱保存5mg溶于稀释10倍即可4％多聚甲醛4g的多聚甲醛，0．8g的氯化钠，2．8g的Na2HP04．12H20，0．26g的溶于1L蒸馏水中，置于60O．01ml的NaCl-2．125岛KCh0．05岛Na2HP04：0．7125舀KH2P04：0．0675g溶于馏水中70％-15淮300Hlmol／L的PBS加入700pl8．2．4细胞接种及盖玻片依次用自来水、蒸馏水清洗，重镉酸浸泡过夜，然后用无水乙醇浸泡2烘干，高压灭菌后储存备用。24孔培养板(Coming)内预先置入处理好的直径为5的盖玻片(每孔一片)。用0．25％胰蛋白酶+0．02％EDTA的混合液消化离心，以2x104／ml的密度接种于含有小盖玻片的二十四孔板上，24h胞24h塞验佥组正常对照组：无血清无抗生素培养液处理24高表达IRPl组：pCMV6-AC．AC01．转染SK-N．SH细胞8．2．5操作步SK-N．SH细胞种植于24孔板中，孔中预先放置高压处理的盖玻片进行免疫荧30min。固定后的培养细胞用0．01mol／LPBS洗3次，O．1％TritonX．100室温处理min，用PBS洗涤一次后正常山羊血清37℃孵育突触核蛋白一抗(1：1000)，4"C冰箱中孵育过夜(16h以上)；用PBS5minx3次；0．05％硫磺素s避光孵育8rnin；80％乙醇洗涤次，70％甘油磷酸次，70％甘油磷酸盐缓冲液封闭。用激光共聚焦扫描显微镜扫描荧光图像。9实验结果以均数士标准误(耀S．E．M．)表示。两组以上均数的比较采用ANOVA)进行比较，继以Student-Newman．Keuls间的比较。P<0．05表明结果有统计学意义结结果1．细胞内铁水平对SK．N．SH细胞存活率的影我们用不同浓度的Fe2+和Fe3+孵育SK．N．SH细胞 h后用MTT法观察细胞活率的变化。结果显示100．300pmol／L结结果1．细胞内铁水平对SK．N．SH细胞存活率的影我们用不同浓度的Fe2+和Fe3+孵育SK．N．SH细胞 h后用MTT法观察细胞活率的变化。结果显示100．300pmol／LFe2+对细胞存活率没有影响mmol／LA)。l，3，10，30孵育后细胞存活率分别降至对照组的87．1％，56．7％(图Fe3+孵育后细胞存活率分别降至对照组的88．O％，64．9％，42．6％，6．15％(图B)多细胞死亡，我们选取AB【loJlcooJo零一童q^o图 MTT法检测不同浓度的铁离子作用SK-N．SH细胞24h后细胞存活率的变Fig．1M'IffanalysisofcellviabilityinSK-N-SHcellswithironA：Theviabilityofcellstreatedwithferrousirofor24hwasunchangedcomparedtothatofobservedwhencellsweretreatedmmol／Lsignificantreductionofviability1-treatedwithl-waswhencellsreductionofferriciron．Datamean士S．E．M．ofindependentexperiments．专withthe我们应用硫磺素S和免疫荧光双染的方法检’狈JJFe2+和Fe3+孵育的SK．N．SH细胞mmol／L的Fe2+(图2alpha．突触核蛋白的聚集情况(图2)。从图2我们可以看出或Fe”(图D／d)孵育细胞外5，10mmol／L的铁离子孵育细胞可产生更加严重的alpha．突触核蛋白的聚集，同青岛大学硕士学SK．N．SH细胞有毒性作用图VE可部分缓解SK-N．SH细胞内铁离子诱导的alpha．突触核青岛大学硕士学SK．N．SH细胞有毒性作用图VE可部分缓解SK-N．SH细胞内铁离子诱导的alpha．突触核蛋白的Fig．2VEcouldonlypartiallyalleviateintracellularironinducedalpha-synucleinSK．N．SHAlmostalpha-synucleingroups(A／a)，whilecouldbeobservedinwasobservedinthecellstreatedwithferrous(B／b)orferricalpha—synucleinaroundthecellularnucleus．Inthe wereaggregationsinthecells，butlessthantheirontreatedgroups．Arrowspointtothepositive3．铁可以部分通过氧化应激诱导SK-N．SH细胞内alpha．突触核蛋白集体的形我们用H2DCF．DA这种荧光探针和FCM检测不同处理组内ROS的生成量。如图所示，lmmol／L的Fe2+(图3A／C)和Fe”(图3B／D)可以导致ROS生成增加VE可完全阻断rtrnol／L)处理后ROS的生成明显减少，5lxmol／L)处理后细胞的Fe2+和Fe”生成的ROS。MTT结果(图3E)显示VE与铁lamol／LVE可使细胞存活率回复正常。于是我们用C／c和图E／e结示，VE和铁共处理组的细胞内认可观察到较少量的聚集体，证明VE不能完全阻断铁诱导i拘alpha-突触核蛋白的聚集的形成。这些结果证实结示，VE和铁共处理组的细胞内认可观察到较少量的聚集体，证明VE不能完全阻断铁诱导i拘alpha-突触核蛋白的聚集的形成。这些结果证实铁诱alpha．突触核蛋白的聚集可以部分通过氧化应激引起，但这并不是唯一途径ABCo5尜叱0圈圈+∞C3ooD一一oJlcoo芑器一∞o世圈圈Eo亡0o0零．>=o∞如加2pM10青岛人学顾l：学位图 andFig．3EffectsofVE青岛人学顾l：学位图 andFig．3EffectsofVEtreatment ferricironSK-N-SHcellsoftheinferrousferricironassaypartiallyblockedbothferrousandferricironinducedROScells．2pxnol／LVEROSgenerationwasbroughttOthenormallevel1esswith5—10pmol／LVEmean士S．E．M．ofindependenttOthevaluestheeonwoll00％．settreatedSK．N．SHcellsfollowedbyadditionofferrousironwasdeterminedbvpartiallybiockedirollinducedassay．2gmol／LVE、，iabilityGanberecoveredtOthenormallevelorevenbetter、历th5．10ttmol／L werepresentedasmean士S．E．M．of5independentexperiments．叩)<O．05．comparedwiththe达所示，在1mmol／LFe”处理组(图4A)和100Itmmol／LDFO处理组(图4B)中mmol／LFeDFO处理组(图4B)中二者的比例下降为25．9％。作为阳性对照ferroportin-IRE．Luc组，比值的调节与alpha-synuclein．IRE．Luc组一致，铁处理组比升高25．4％，DFO处理组中降低28．5％。结果说明构建的alpha-synuclein．IRE．Luc质R对alpha．synuclein．IRE—Luc质粒的表达进行转录后调结皇§拿意星毫鼍；童星芑21羔。图4细胞内铁水平可调节alpha．synuclein．IRE．Luc在HEK293细胞内的Fig．4Iron-dependentregulationofluciferaseactivityin结皇§拿意星毫鼍；童星芑21羔。图4细胞内铁水平可调节alpha．synuclein．IRE．Luc在HEK293细胞内的Fig．4Iron-dependentregulationofluciferaseactivityinHEK293After24h vectors(pGL3一control，alpha—synuclein—IRE—bypRL-theratioferroportin—IRE—incubatedwithl11．tmmol／LDFO(B)for24h，andthendualluciferasereporterassaywasconducted．Luciferaseinalpha·synuclein-IRE-Lucgroupwasthanthecontrolgroupirongroups．AnditwaslowerDFOwereobservedgroup．Similarwhichwereferroportin-II迮-Lucgroups．TheluciferasebeennormalizedfortheRenillalightunitsbymean4-S．E．M．ofindependentexperiments．奉pRL-withthecontrolofferricthecontrolofthe5．细胞内1表达水平可调节alpha—synuclein．IRE．Luc的表如图5所示，在转染pSilellcerⅢ1．0．U6．IRPl组(图A)和转染组(图5B)中，阴性对照组的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值设为100％。转染pSilellcer¨Ⅵ1．O．U6．IRPl组@alpha—synuclen．IRE．Luc组中二者的比值较对照高23．0％。而在pCMV6．AC—AC01处理组中比值下降21％。作为阳性对照 比值的调节与alpha-synuclein—IRE．Luc组致．pSilencer删1．0一u6．IRPl组和转染pCMV6．AC．AC01平的调节，IRPl可能通过插入的类IRE对alpha—synuclein．IRE．Luc质粒的表达进行录后调节。由此我们推断类IRE为功能性元件，细胞内铁水平可通过IRE／IRP青岛人学硕Ij学位论alpha—synuclein—IRE—Luc进行转录后调节}．．．．上+薛拌pCMV6-AC-图IPJpI表达水平可调节alpha-synuclein—IRE-Luc在HEK293细胞内的ofactivityHEK293Fig．5IRPl-dependentCellsweretransfectedwiththreeplasmidmixtureinratio1：20：80(pRL—青岛人学硕Ij学位论alpha—synuclein—IRE—Luc进行转录后调节}．．．．上+薛拌pCMV6-AC-图IPJpI表达水平可调节alpha-synuclein—IRE-Luc在HEK293细胞内的ofactivityHEK293Fig．5IRPl-dependentCellsweretransfectedwiththreeplasmidmixtureinratio1：20：80(pRL— pCMV6-AC—1”1．0一U6一 1pCMV6一AC—alpha—synuclein—IRE—ferroportin—IRE—isobservedwhichwerethepositivecontrolgroups．ThereportedvaluesofFireflyluciferasehavebeenfortheluciferaseunitsbycotransfectingthepRL-TKplasmid．Datamean士S．E．M．ofindependentexperiments．幸P<0．05．comparedthecontrolwiththecontrolofpCMV6-AC-ACO16．干涉n-]I-i压]SK—N．SH细胞内alpha一突触核蛋白为了验证上面的实验结果我们在SK-N—SH细胞内观察IRPl表达是否可以alpha-突触核蛋白mRNA和蛋白水平的变化。如图6所示，半定量PCR结果显示转pSilenc盯兀Ⅵ1．0．U6．IRPl质粒组的alpha．突触核蛋白mRNA表达量较对照组和空载组明显增加，Westernblot(图7)结果和荧光双标(图8)结果均显示，干涉IRPl的alpha．突触核蛋白的表达水平较对照组明显增加(尸<O．05)，而高表达IRPl组较照组无明显改变。实验结果表明细胞alpha-突触核蛋白mRNA和蛋白的表达水平IRPl的蛋白表达水平调节，在细胞内干涉IRPl可使alpha．突触核蛋白mRNA结Alpha—豳|。工(：In《G、c—G—c一一c>让．正L|c一冗-cmRNAlevelwereup-regulated结Alpha—豳|。工(：In《G、c—G—c一一c>让．正L|c一冗-cmRNAlevelwereup-regulatedinSK-N-SHceHswithIRPlFig．6Alpha-mRNAwasinthepSilencerTMAlpha—therewassignificantobservedincontrolandpSilencerTM1．0一U6groups．MouseGAPDHwascontr01．Dataastheofalpha-toGAPDH．Eachtothecontrolexperiments．宰尸thepSilencerTM嘲—_嘲— Alpha-哥cllu对．对：l矗q／cx∞．时工A一时oopCMV6一AC—pSilencerl．0一U6一图7于涉IP,P1可增加alpha-突触核蛋白在SK-N．SHFig．7Down-regulationenhancesalpha-synucleininSK-N．SHA：Western嘲—_嘲— Alpha-哥cllu对．对：l矗q／cx∞．时工A一时oopCMV6一AC—pSilencerl．0一U6一图7于涉IP,P1可增加alpha-突触核蛋白在SK-N．SHFig．7Down-regulationenhancesalpha-synucleininSK-N．SHA：Westernblotstoalpha-synucleinobservedtransfectedtransfectedcells．Beta．actinWasusedpCMV6一AC-contr01．B：Statisticalbarrepresentedthemean4-S．E．M．ofwerem'esentedastheratioofalpha．synucleinindependentexperiments．謇尸<O．05．comparedtothe结莹CApSilencerl．0-U6-pCMV6-AC-b国CpCMV6-AC-pSilencerl．0-U6-图8干涉IRPl可增加alpha．突触核蛋白在SK．N．SHIRPIup-regulatedalpha—synucleinexpressionand结莹CApSilencerl．0-U6-pCMV6-AC-b国CpCMV6-AC-pSilencerl．0-U6-图8干涉IRPl可增加alpha．突触核蛋白在SK．N．SHIRPIup-regulatedalpha—synucleinexpressionandpromotedSK．N．SHwereinducedpSilencer⋯1．0一U6一Alpha—synucleincontrol(A／a)．NosignificantchangeWaSobservedinpCMV6-AC-group(B／b)compa