中药川芎中川芎嗪提取工艺优化的研究

目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 I第1章引言 2第2章实验方法 32.1色谱分析方法 32.1.1标准品配制及标准曲线绘制 32.1.2精密度实验 42.1.3重复性实验 42.2提取溶剂的选择 52.3提取溶剂浓度的选择 52.4提取次数的选择 52.5提取液料比的选择 62.6川芎嗪提取工艺的优化 62.7验证性实验 6第3章实验结果与讨论 73.1不同提取溶剂的提取效果比较 73.2不同乙醇浓度的提取效果比较 73.3不同提取次数效果比较 83.4不同液料比提取效果比较 83.5正交实验结果 9结论 11参考文献 第1章引言川芎嗪能够保护心、脑等重要脏器受到缺血灌注损害的作用，其抗心肌缺血反流的机制体现在多个方面，如保护线粒体、吸收氧自由基、抗凋亡、抗凋亡等，抑制脂质过氧化，促进能量代谢，抑制钙超载，维持钙稳态等。在上述作用机制的基础上，发挥着维持人体不同脏器正常生理功能的目的[1-4]。在对川芎嗪的既往药理学研究中，存在众多抗血栓、抗缺血损伤的案例。川芎嗪还能抗凝血，降低血液总粘度。其机制主要是通过调节血小板、淋巴细胞和红细胞中CXCR4的表达水平[5]，除上面所述外，川芎嗪还可以延缓和抑制血管平滑肌细胞的增殖，扩张血管，保护血管内皮细胞。心脏的病理状态常表现心肌收缩、心肌细胞活性差、心肌肥大等现象。川芎嗪可以调节和改善心脏的生理功能，能够发挥抑制收缩、保护细胞的作用。家兔心室肌的钙瞬变和收缩实验显示，无论是否存在异丙肾上腺素的作用，川芎嗪给药后，均可抑制心室肌细胞L型钙通道的钙内流[6]。川芎嗪对心脏有支持作用，还对大脑损害也有许多种支持保护作用，其主要是通过抗氧化，清除氧自由基等多种渠道，通过减轻氧化应激损伤，降低细胞外雌激素液中无自由基羟基和多巴胺的代谢含量，保持人体内多巴胺总水平，增加ldopa作用时间[7]。肝纤维化是肝脏最常见的病理状态。川芎嗪能够通过多种途径改善肝脏纤维化的进程和程度，由此来实现对肝损害的保护治疗作用。川芎嗪抗肝纤维化是通过限制肝星状细胞的繁殖，促进肝蛋白酶的表达，降低细胞外基质[8]。根据国外有关报道，川芎嗪可改善三七诱发的小鼠肝静脉阻塞性疾病[9],亦能够阻滞和延缓大鼠肝硬化的发展进程，通过降低大鼠leptin、TGF-β1的表达水平。川芎嗪对肾脏也有很好的保护作用，主要通过延缓肾细胞的衰老、抗氧化，清除氧自由基的方式来降低肾功能损伤和肾纤维化的形成。川芎嗪能降低血清肌酐、尿素氮和24小时尿蛋白，延缓小鼠的早期慢性肾功能不全和后期小鼠慢性肾衰发病的进程。与此同时，还能够增加HIF-α和VEGF的蛋白表达以及肾小管间质微血管的增殖[10]。川芎嗪能限制肝癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞的无限增殖。川芎嗪还可以切断肿瘤细胞的繁殖周期，从而使肿瘤细胞自我消亡，自我吞噬，增强人体对癌细胞侵袭的抵抗力，大大降低了癌细胞的耐药性，提高免疫功能等多种有效方法发挥临床治疗作用[11]。研究显示，处于兴奋时期的大鼠经给予川芎嗪后，其状态变的安静，这说明川芎嗪能够起到镇静催眠的效果。此外，根据现代药理研究表明较大剂量川芎嗪和安全剂量下的戊巴比妥钠合用对小鼠有更好的催眠效果，并且还延长同剂量下戊巴比妥钠对小鼠的镇静催眠的时间[12]。近年来对于川芎嗪提取方法的研究表明，中药川芎中川芎嗪的提取在各大研究实验室、工厂都采用的是简单乙醇提取，酸碱处理的方法，但是它们都由于提取时间过长，所耗经费过高各种原因被排除在工业化生产之外，不能进行大规模的生产。所以，为了能大规模生产，提高经济效益。科研工作者对提川芎嗪提取工艺优化进行了大量的科研实验，根据赵莉恋[13]对于川芎嗪研究的结果为评价依据，对川芎嗪的提取工艺优化进行了大量的科研实验，众多结果显示，用80％的乙醇来提取川芎嗪，第一可提取2小时，第二次可提取1.5小时，用超临界流体萃取技术提取，但是由于该技术操作较复杂，用时多，成本过高。所以，有一些科研工作者提出了还在试验阶段的一种低压溶剂，这种溶剂叫非氟氯酮溶剂，用它来提取中药中的一些活性物质，如丹参酮。刘本[14]等科研工作者发现并整理了何种溶剂对川芎中川芎嗪提取的效率最优。通过实验他发现采用多索溶剂和超临界CO2加10%甲醇来提取川芎嗪时效率最优。吴青[15]等科研工作者，采用双萃取法提取川芎，通过正交试验确定了川芎嗪的最优提取工艺并解释了大致的提取操作步骤，加水量为总药材量的8倍，提取挥发油必须达到8个小时，冷却后收集挥发油为下一实验步骤做准备。将水提取部分在较高温对下过滤，从而减少川芎嗪及有效物质的流失。过滤溶液的相对密度为1.01-1.02(55-60℃)，添加95%的乙醇使乙醇的含量达到百分之六十，然后冷库里储藏24小时，最后浓缩，在80℃时减压干燥就可得到川芎嗪。因而，如何找到合理先进的提取方法，促进川芎制剂的现代化，是摆在广大科研工作者面前的重大课题。因此，本实验尝试通过控制变量的方法，找到较为合适的川芎嗪提取方法。经过各种实验研究，本实验最终选择了回流提取法，以优化川芎中川芎嗪提取工艺。第2章实验方法2.1色谱分析方法2.1.1标准品配制及标准曲线绘制准确称取川芎嗪对照品1.0mg，将其放于10ml容量瓶中，采用甲醇溶液定容，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液。然后将以下剂量：0.2ml、0.4ml、1ml、2ml、4ml和8ml的对照储备液用胶头滴管吸取于10ml容量瓶中，然后用甲醇溶液充分定容后摇匀，从而得到若干浓度条件下的对照品。再次取5μl对照品进样进行对照，获得并读取到液相色谱峰面积值。以浓度（C）为横坐标，以峰面积值（A）为纵坐标，进行线性回归，并得到线性回归方程为：Y=223.9x+10.85，r=0.9998，根据实验结果显示：在0.002-0.08mg/ml内具有较好的线性关系。详见图2.1。图2.1标准品配制标准曲线绘制2.1.2精密度实验准确吸取对照品溶液5μl，连续进样6次，按照上文所提到的实验方法进行测定并计算RSD值，所得RSD为0.48%，表明精密度良好，可以进行后续实验。详见表2.1。表2.1精密度实验结果（n=6）峰面积RSD/%1273.97970.48%1279.06891274.75791257.23001296.48742.1.3重复性实验准确吸取相同批次供实验所需的样品溶液中的6个样品，运用以上的方法进行准确测算RSD值，获得RSD为2.59%，因此表明此方法重现性好，所以可以继续后面的实验。详见表2.2。表2.2重复性试验结果（n=6）峰面积川芎嗪的含量川芎嗪的平均含量RSD/%1258.57012.7862.8462.59%1344.99552.9801265.98022.8021259.04532.7881289.96512.8561294.44152.8662.2提取溶剂的选择取川芎，粉碎后过筛，准确称量5.0g，共准备6份，以甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、石油醚、水为提取溶剂，所需用量均为50ml，回流1.0h后，充分过滤，滤液经过减压浓缩并蒸干，用色谱甲醇充分溶解，定容后放入体积为10ml的容器中，以此获得供试品溶液[16]。运用0.45μm的微孔滤膜过滤溶液，取续滤液5μL进样至高效液相色谱中检测，测定川芎嗪的峰面积，平行测定两次取平均值，代入标准曲线方程，获得川芎嗪浓度，进一步计算川芎嗪含量。最后，将不同溶剂提取样品所对应的川芎嗪含量进行比较，以含量最大者为最佳，从而筛选出最佳提取溶剂。2.3提取溶剂浓度的选择取得七片川芎药品将其进行充分粉碎，然后精确称取5.0g，共5份，将其分别加入20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液中，作为提取溶剂，使用量为50ml（10倍），回流1小时后，过滤，将滤液减压浓缩并蒸干，溶于色谱甲醇之中，充分定容于10ml的容量瓶中，用0.45μm微孔膜进行过滤，以此获得供试品溶液，取得续滤液5μL进样到高效液相色谱中进行检测，通过检测获得其川芎嗪的峰面积，将所获得的试验结果取两次的平均值，将其代入线性方程，计算获得获得川芎嗪浓度，从而进一步计算提取得到的川芎嗪含量。2.4提取次数的选择取川芎药材，粉碎过筛，精密称取5.0g，选取60%乙醇作为提取溶剂，加入总体积50mL，回流提取4次，且每次都提取3h。提取两次时，将第一次的提取液与川芎药材分离，随后重新加入到川芎药材中进行第二次提取。提取三次时，则在提取两次的基础上再重新分离一次，提取四次时以此类推。提取结束后，将每次的提取液收集起来，样品溶液经真空浓缩、蒸发后，溶于色谱甲醇中，置于10ml容量瓶中，得到供试品溶液，将所得到的四种供试品溶液分别用0.45μm微孔膜依次进行过滤处理，然后将取得续滤液5μL并进样到高效液相色谱法（HPLC）中进行检测，随后测定川芎嗪的峰面积，试验结果取两次平行测定的平均值，将其代入线性方程进行计算，获得川芎嗪的浓度，从而进一步计算样品中川芎嗪的含量。2.5提取液料比的选择据文献报道，川芎中川芎嗪的提取受液料比（即溶剂与药材的比例）的影响很大，因此，我们还考察了川芎中川芎嗪的适宜液料比。取川芎七片，粉碎后过筛。准确称取5.0g，选用60%乙醇为提取溶剂，按6倍（30ml）、8倍（4ml）、10倍（50ml）的料比加液，将其回流提取1次，提取时间为3小时，随后收集各提取液，进行减压浓缩并蒸干，运用色谱甲醇溶解，充分定容于10ml玻璃杯中，然后获得供试品溶液。将四种供试品溶液依次分别通过0.45μm微孔滤膜，取得的续滤液5μL进样到HPLC中检测，随后测定川芎嗪的峰面积值，平行测定两次取值并取其平均值后代入线性方程，获得川芎嗪的浓度，进一步计算样品中川芎嗪的含量。2.6川芎嗪提取工艺的优化在探究川芎中川芎嗪的最恰当提取工艺中，以单因素实验为基础,进一步选取乙醇浓度（A）、液料比（B）和提取次数（C）3个最主要的影响因素，运用L9(33)正交表法，各因素水平如下表2.1所示，准确进行正交试验，并对实验所取得的结果进行分析，确定提取川芎嗪的最佳工艺。精密称取川芎药材，进行充分粉碎后过筛，准确称取5.0g，按照下面表格所列的实验因素及水平进行实验，并利用线性回归方程计算川芎嗪浓度，进一步求得相应的川芎嗪含量，通过正交分析，从而确定最佳提取工艺。表2.1正交试验因素水平因素ABC水平乙醇浓度(%)液料比(倍)提取次数160%62280%833100%1042.7验证性实验取川芎粉末10.0g各三份，分别加入500ml的圆底烧瓶中，按照上述实验得到的提取川芎中川芎嗪的最优提取条件为：A2B3C3，即80%浓度乙醇溶液，10倍量溶液体积，提取四次。在此最优条件下，我进行了三次验证性实验，结果见下表2.2，通过计算可得到相对偏差（RSD）值为0.1%，表明最优条件真实可靠，故可以证明该提取工艺是最优的提取工艺，并且稳定，可靠可行。表2.2验证性实验序号123平均值相对标准偏差(%)川芎嗪含量mg0.150.170.260.1900.1第3章实验结果与讨论3.1不同提取溶剂的提取效果比较实验结果如下表3.1所示，该结果表明，相对于甲醇（0.228mg）、乙酸乙酯（0.212mg）、丙酮（0.205mg）、石油醚（0.193mg）和水（0.201mg），用乙醇做溶剂提取的样品中其川芎嗪含量最高（0.254mg），结果表明，乙醇是川芎嗪的最佳提取溶剂，因此本实验选择乙醇作为川芎嗪的提取溶剂，并对后续工艺进行了优化。表3.1不同提取溶剂的提取效果比较溶剂川芎嗪（mg）甲醇0.228乙醇0.254乙酸乙酯0.212丙酮0.205石油醚0.193水0.2013.2不同乙醇浓度的提取效果比较不同乙醇浓度的提取效果结果见表4。实验结果表明，相比于20%和40%乙醇提取得到的0.216mg和0.227mg川芎嗪，利用60%、80%和100%乙醇溶剂进行提取的样品中所得的川芎嗪含量更高,分别为0.254mg、0.263mg和0.249mg，其中80%乙醇（0.263mg）的提取效果最好。但由于60%、80%和100%乙醇的提取效果相差不大，为更加全面细致地进行工艺的优化，因此，本实验保留60%、80%、100%浓度，并将其作为后续正交试验的溶剂浓度因素水平。详表3.2。表3.2不同乙醇浓度的提取效果比较溶剂川芎嗪（mg）20%0.21640%0.22760%0.25480%0.263100%0.2493.3不同提取次数效果比较不同提取次数的提取效果见表3.3。通过将上述四种样品的川芎嗪含量进行比较，发现川芎嗪含量比较顺序为四次>三次>二次>一次。首先，这一结果表明，虽然总的提取时间不变，随着提取次数的不断增加，所得到的川芎嗪量也随之增加。但值得注意的是，随着提取次数的增加，每一次提取出的川芎嗪量随之不断减少，二次提取时，提取的川芎嗪量为0.092mg(=0.226-0.134）,到了第三次提取时，提取出川芎嗪量为0.057mg(=0.283-0.226)，到第四次提取时，仅仅提取出0.008mg（=0.291-0.283）的川芎嗪，几乎无法提取出川芎嗪。因此，本实验表明，在总提取时间不变的前提下，多次提取可以更加有效的提取出川芎药材中的川芎嗪，其中三次提取可以比较充分的提取出药材中的川芎嗪，第四次提取几乎无法提取出川芎嗪。出于成本收益的考量，我们建议进行多次提取，提取次数为三次。不必进行第五次的提取。为此，本实验将提取次数设为两次、三次、四次、作为后续正交试验的提取次数因素水平。表3.3不同提取次数效果比较提取次数川芎嗪（mg）一次0.134两次0.226三次0.283四次0.2913.4不同液料比提取效果比较结果如表3.4所示，结果表明不同液料比确实会影响川芎嗪的提取效率，其中10倍液料比的提取效率（0.183mg）>8倍液料比的提取效率（0.172mg）>6倍液料比的提取效率（0.134mg）。但是10倍液料比相比于8倍液料比提升的效率（0.011mg）并不高。出于成本与收益的综合考虑，我们建议选择8倍液料比进行川芎嗪的提取。表3.4不同液料比提取效果比较液料比（倍数）川芎嗪（mg）60.13480.172100.183综上，通过溶剂实验，可以发现乙醇溶剂在所选溶剂中表现出最强的提取能力；浓度实验表明，60%、80%、100%乙醇浓度能够取得较好的提取效果，三种方法无显著性差异；提取次数与时间表明，随着提取次数和时间的延长，川芎嗪的提取率就会提高，但是在第四次的提取过程后，其提取样品的色谱峰值极小，故考虑可能是在前期三次提取实验中川芎嗪的提取量已经几乎达到饱和状态，表明四次提取已经能够充分提取出样品中的川芎嗪。在液料比的选择中，随着液料比的提升其提取效率随着上升，但是10倍液料比相对于8倍液料比提升的很小。综合以上实验结果，在单因素实验基础上，我们将以溶剂浓度、提取次数以及文献报道中的液料比这三个对提取量影响较大的因素，开展后续的正交试验，从而筛选川芎中川芎嗪提取的最佳工艺。3.5正交实验结果对正交试验结果进行分析，详表3.5，以川芎嗪的提取量为评价指标，对溶液浓度（A）、液料比（B）、提取次数（C）这三个因素对中药川芎中川芎嗪提取量的影响程度进行了调查，由表中极差R的大小可以得出这三个因素的影响程度为A>B>C。因此可以确定通过正交试验筛选所获得的最好提取工艺为A2B3C3，即80%浓度乙醇溶液，10倍量溶液体积，提取四次。由于，考虑到因素C（提取次数）对于川芎嗪提取量的影响程度是三个因素中最弱的，且提取四次时的川芎嗪含量与提取三次时相差极小。因此，综合考虑实际情况，为减少人力和物力，故建议缩短半小时的提取时间，从而起到节约成本、大规模工业生产的作用，我们最终认为川芎嗪的最佳提取工艺为A2B3C2。详表3.6。表3.5正交试验结果及分析序号A(%)B(倍)C(次数)川芎嗪(mg)140610.147250820.1633601030.158450620.173560830.267680810.2327100830.1678601010.179980620.249K113.39713.20112.368K213.57612.38413.283K312.42313.80413.718R0.4730.4430.384表3.6正交试验设计的方差分析方差来源偏差平方和自由度F值显著性A0.6072645.16P＜0.01B0.9282985.55P＜0.1C0.7372783.28P＜0.05误差0.008结论1、由于川芎嗪容易升华，因此必须应尽可能地控制萃取液中的温度，以避免川芎嗪的高温升华，特别是在回收和干燥过程中，一定要把温度控制在60℃左右。2、单因素实验中，溶剂选择组实验结果表明，我们所选的不同提取试剂中乙醇的提取效果最优，所以，采用乙醇作为提取溶剂进行了后续实验；提取过程中浓度不同的乙醇所获得的提取效果显示，60%，80%,100%乙醇浓度相比于20%和40%乙醇的提取效果更好，其中80%乙醇效果最好。但由于三者差异不是很大，因此后续以60%、80%和100%乙醇作为正交试验的浓度因子水平；不同提取次数的实验表明，川芎嗪的含量随着提取次数的增加而增加，但每次提取的芎嗪含量却在不断降低，至第四次的提取时，所能回收的川芎嗪含量相比于前几组明显下降。出于成本及效益的考量，我们不建议进行第四次的提取。在液料比的选择中，随着液料比的提升其提取效率随着上升，但是10倍液料比相对于8倍液料比提升的效果很有限，我们建议在提取时选择8倍液料比进行实验是最合适的。3、根据单因素考察实验显示，将最后选定的溶液浓度、提取次数和时间作为川芎嗪提取工艺优化的主要参考依据。本次实验运用溶液浓度、提取次数与液料比率作为重要的参考指标，以此设计了三因素正交试验。通过分析溶液浓度、液料比、提取次数这三个最重要的因素水平进行正交试验并且分析了其实验结果，最终发现溶液浓度（A）、液料比（B）、提取次数（C）这三个主要因素对于中药川芎中川芎嗪提取率的影响程度，分别为A>B>C。最优提取工艺为A2B3C3，结果为80%浓度的乙醇，10倍量溶液体积，提取四次，但结合实际因素，考虑到节约成本，减少人力、时间等外界因素，最后认定川芎嗪的最佳提取工艺为80%浓度乙醇，10倍量体积，提取三次。参考文献[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社，2015．[2]何晶.川芎嗪的药理作用及临床应用[J].首都医药，2005,12(23):31-32.[3]韩炜.川芎的化学成分与药理作用研究进展[J].中国现代中药，2017，19(9):1341-1349．[4]QianWD，XiongXJ，FangZY．Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonmyocardialischemia-reperfusioninjury[J]．EvidBasedComplementAlternatMed，2014，2014:107501．[5]CaiXX，ChenZ，PanXK．Inhibitionofangiogenesis，fibrosisandthrombosisbytetrame