细胞凋亡及其调控的分子机制

第二十一章

细胞凋亡及其调控的分子机制细胞凋亡的根本概念:细胞凋亡〔apoptosis)(有树叶凋零之意)或程序化细胞死亡〔programmedcelldeath,PCD)是指多细胞有机体在正常生理或病理情况下，发生的一种由多基因控制的主动死亡过程。细胞凋亡的发现

1951年，发育生物学家Glucksman在研究蛾的发育时提出PCD一词；1972年，Kerr等对肝细胞溶酶体的组化研究发现，结扎大鼠门脉左侧支数小时后引起肝左叶细胞片状死亡，但不同于细胞坏死，因而将细胞的这种死亡命为细胞凋亡。大多数情况下程序化细胞死亡的形态学表现为细胞凋亡.第一节凋亡细胞的特征及生物学意义(一)细胞凋亡的组织学变化只发生在单个或几个细胞，其紧邻细胞完好；与紧邻细胞间有空隙，有离群、脱落感；不引起炎症反响(二)主要形态学特征(多阶段)凋亡细胞其形态特征表现为细胞皱缩、变小；核固缩，胞质浓缩，细胞急剧变小；细胞骨架解体，最后变成假设干个凋亡小体。注意点：凋亡全过程，质膜仍保持完整，细胞内容物不释放，不引起炎症反响。一、细胞凋亡的根本特征1.细胞核的变化核内染色质凝聚、形成染色质块，并聚集于核的边缘呈多种形状排列，然后逐步分裂为碎片〔核碎片形成〕。2.细胞质的变化(1)胞质脱水浓缩，体积减少约30%(2)细胞器的变化:A.线粒体早期体积增大，嵴增多晚期成空泡状,B失去微绒毛、细胞突起及细胞外表皱褶，膜电位下降，膜流动性下降；C.内质网腔扩大；D.细胞骨架变得致密和紊乱。MorphologicalFeaturesofApoptoticCells3.凋亡小体的形成*凋亡小体的概念指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。*形成机制〔1〕细胞外表突起形成-------包裹膜融合、根部缩窄→脱落〔2〕胞内自噬体形成-------向胞外释放应指出！有时凋亡细胞膜不分割，仅发生核固缩和胞质高度浓缩成单个致密结构亦称凋亡小体。凋亡时细胞的形态学改变空泡化固缩出芽边集凋亡小体(二)细胞凋亡的生化特征1.DNA片段化〔主〕凋亡细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱〔Ladder〕。机制：核小体中的组蛋白与DNA的连结键断裂，内源性核酸内切酶被激活，有控制的特异地将DNA降解为180~200bp整数倍大小的假设干条带。DNAFragmentation

NucleosomalBandingPattern3.其它生化改变1)胞浆Ca2+水平

与细胞凋亡的关系密切，实验证明，凋亡的发生伴随胞浆Ca的升高。2)胞浆H离子浓度

细胞凋亡伴随胞浆PH下降。3)线粒体

凋亡时，呼吸链受损，ATP合成下降，膜电位下降(Δψm)；膜通透性增加。4)细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻膜磷脂的不对称性分布改变,凋亡时PS由质膜内侧翻向外侧.〔二〕细胞凋亡与坏死的区别-1细胞凋亡细胞坏死诱导因素细胞数量膜完整性染色质细胞核细胞器胞内容物生理性、弱刺激性单个细胞丢失保持至晚凝聚呈半月状早期固缩、断裂无明显变化无释放强烈刺激成群细胞死亡早期即丧失稀疏呈网状晚期破碎肿胀、破坏释放细胞凋亡细胞坏死细胞形状基因组DNA大分子合成基因调控后果意义形成凋亡小体受调控降解一般需要有不引起炎症反应生理性死亡破裂成碎片随机降解不需要无引起炎症反应病理性死亡细胞凋亡与坏死的区别-2二、细胞凋亡的广泛性及其意义细胞凋亡的生物学意义其一:具有去除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用其二:具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用因此，细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制第二节细胞凋亡的发生机制一、细胞凋亡的酶学根底细胞内一系列蛋白酶和核酸酶的活化是凋亡过程的核心事件。有人甚至认为细胞凋亡过程就是蛋白酶级联反响的过程。〔一〕caspase家族与细胞凋亡Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Cysteinylaspartate-specificprotease);是一类与白介素-1ß转化酶和线虫凋亡基因Ced(ICE/Ced)同源的一类半胱氨酸蛋白酶;活性位点含有保守的aa序列(QACXG,X为R,Q或G);以无活性的酶原形式合成并存在于细胞中；可以被上游Caspase或自身切割保守的ASP活化；1.Caspase的性质和种类已在哺乳类中发现14种，分为3个亚类：Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族亦可根据前体分子(procaspase)N端的原结构域(prodomain)分为2类:具〞Long-prodomain〞的启始分子(initiator),如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反响的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；具〞short-prodomain〞的效应分子(effector),如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。2.Caspase的结构特点和活化机制原结构域大亚基小亚基N端D28QACRGD175IETDCaspase异二聚体化异四聚体化蛋白酶活性ActiveCaspaseProcaspaseProdomainLargeSubunitSmallSubunitCaspaseActivationbyCleavage3.Caspase活化的级联反响过程多种凋亡因素，通过多种途径活化Caspase;凋亡时起始Caspase首先被活化,其后又切割并活化下游Caspase,级联放大,直至效应Caspase被活化；细胞中的Caspase一旦被活化,凋亡即不可防止;SignalSubstratesExecutionProteasesAmplifiersProteasesInitiatorProteasesSignalCaspase8,10,Intrinsicpathway:9Caspase3,6,and7???PARP,Laminsetc.4.效应caspase引起细胞凋亡的机制已发现的caspase底物上百种,仅少数底物与凋亡的关系被确认;灭活细胞内凋亡抑制蛋白非凋亡细胞中,CDA(caspase活化的DNAase)与其抑制蛋白(ICDA)结合;凋亡细胞中,caspase剪切ICDA;CDA游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡.剪切细胞结构蛋白如Caspase对核板的降解作用;在凋亡过程中,caspase在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin),导致核板塌陷,染色质浓缩.剪切效应蛋白:如参与基因表达蛋白因子,如PARP活化caspase抑制剂(二)介导细胞凋亡的其他酶类核酸内切酶(endonuclease)主要是DNase,包括DNaseⅠ、DNaseⅡ、NUC18等；大多数DNase在细胞凋亡时作为caspase的底物被活化并发挥作用，如CAD等；其作用点是核小体的连接处切割DNA，产生180~200bp的Ladder.蛋白激酶(proteinkinase，PK)PKC可通过caspase相互作用影响细胞凋亡；DNA-PK〔DNA依赖性蛋白激酶〕，活化后参与DNA损伤与修复，能抑制凋亡，能被caspase-3灭活。其他酶类：丝氨酸蛋白酶〔如粒酶B〕、calpain、NOS等二、细胞凋亡的信号传递途径细胞凋亡的影响信号分为2类：一类为凋亡的负调控信号〔抑制凋亡〕；另类为凋亡的正调控信号〔诱导凋亡〕细胞凋亡信号转导通路的特点：同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为根本传导通路和非专一性传导通路二类。〔一〕死亡受体介导的细胞凋亡死亡受体(deathreceptors,DR)：指细胞外表存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体。属肿瘤坏死因子受体〔TNF〕超家族；包括1~6个富Cys结构域组成的保守的胞外区，和一个由60~80aa组成的“死亡结构域〞(deathdomain,DD)；DD将受体信号与胞内凋亡机制相偶联；分类：CD95(Fas/Apol),TNFR1,TNFR2,DR3(Apol3/Esl1)等近十种。“死亡结构域〞概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导细胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。种类：FADD：fas-associateddeathdomain(Fas相关的死亡结构域)；TRADD：TNFrecptor-associateddeathdomain(TNF1受体相关的死亡结构域)；RIP：receptorinteractingprotein(受体相互作用蛋白)〔含相似的死亡域〕DD的活化或过表达都会导致细胞凋亡.TNFTNFTNFDDDDDDTNFR1DDDD死亡诱导信号复合物(DISC)形成DDRIPDDFADDDED活化NF-қB，AP-1促进炎症，免疫反响等活化Caspase-8Caspase级联放大细胞凋亡TRADD〔二〕线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径线粒体细胞凋亡过程中既是引发器，又是信号放大器；几乎所有的诱导剂引起的细胞凋亡都伴随着线粒体跨膜电位(Δψm)的下降;Δψm的维持，与线粒体膜通透性转运孔〔MPT〕局部相关；几乎所有的凋亡诱导因素导致MPT破坏或开放；开放的后果是，Δψm下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。MPT的这种自我放大效应，很可能是一种细胞死亡“全或无〞的开关。线粒体释放的凋亡诱导分子在多种诱导因子〔如Bax过表达、UV照射〕作用下，MPT开放和外膜破坏；线粒体释放多种凋亡相关分子，如CytC、Smac、EndoG等细胞色素C：释放到胞质中的CytC，可特异性地结合接头蛋白Apaf并使之寡聚化，Apaf借助N-端caspase相关征蓦结构域〔CARD〕,直接蓦集多个caspase-9并使之活--------凋亡。〔三〕细胞核凋亡诱导途径〔略〕细胞毒T淋巴细胞杀伤靶细胞的机制之一，就是通过粒酶B来实现的。粒酶B的特点粒酶〔cranzyme,Cr〕是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称；首先酶原形式合成，受刺激后激活；已发现5种：CrA、B，H、M和类胰蛋白酶-2;其中以CrB促凋亡作用最强;〔三〕粒酶B介导的细胞凋亡粒酶B诱导细胞凋亡的途径CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH7.0条件下发挥最正确活性，切割胞浆和核中的多种底物；以此介导的死亡途径是多层次、多水平的，以便快速去除异常细胞；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一：在体外，pro-Caspase家族中，除-1外其余的都可被CrB切割活化，-10和-7是CrB的最适底物；线粒体介导的死亡途径是另一个重要的途径：需要多种蛋白质〔如Bax、Bid、Bak〕参与，与线粒体膜通透性及Δψm有关。死亡受体(Fas/CD95,TNFR1)CD95配体,TNF-αFADDCaspase-8,10Caspase-3,6,7PARP,Lamin,PK,DNA-PKDNA断裂,细胞固缩等细胞凋亡Caspase激活物起始Caspase效应CaspaseCaspase底物CTL粒酶B,穿孔素胞外CrB生长因子撤除,化学药物等CytCApaf-1Caspase-9AIF,endoG凋亡主要途径小结第三节细胞凋亡的调控目前普遍认为，细胞凋亡与细胞分裂、分化类似，受细胞内多种基因的调控，是一个级联式基因表达的结果。已发现许多基因参与细胞凋亡的基因调控，包括：ced、bcl-2、ICE、p53、IAP家族、Fas/Apo、c-myc等。至今调控机理尚未十清楚了。P53的结构：p53基因位于人染色体的17p13.17，编码53kDa的P53蛋白转录因子；野生型P53蛋白由393aa组成，活性形式为四聚体；自N端起包括：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；C-端的26aa构成一个开放的结构域，易被降解或磷酸化修饰，受其他蛋白调节。一、细胞自身蛋白的调控作用〔一〕P53蛋白的调控作用P53的表达与活性调节正常状态下：胞浆P53水平很低，半衰期很短，胞内P53被严格监控，受HDM2的负反响调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。异常情况下：当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时；P53水平迅速升高和活化；P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用野生型P53蛋白：具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；P53蛋白作为“基因警卫〞负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。突变型P53蛋白：丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。P53蛋白——基因卫士P53蛋白解链酶复制因子AP21蛋白细胞停滞于G1期细胞凋亡酸性区核心区碱性区P53蛋白DNA损伤P21基因P53蛋白抑制P53蛋白成功修复修复失败细胞周期(二)Bcl-2基因家族bcl-2基因bcl-2基因发现于1985年。定位于18q21基因长约230kb〔2个内含子各3个外显子〕，编码23kd膜镶嵌蛋白质，与Ced-9有23%的同源性。Bcl-2对需要长期生存的细胞,如神经细胞、免疫记忆细胞和造血祖细胞等的寿命有重要意义。急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，细胞膜内Bcl-2蛋白质增加显著。Bcl-2的功能属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。Bcl-2蛋白具抗氧化作用Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+离子参与。bcl-2家族家族成员可能存在的聚合体形式抑制凋亡促进凋亡bcl-2

Bcl-2/Bcl-2Bax/Bcl-2bcl-xLBcl-xL/bcl-xLBcl-2/Bcl-xL

baxBax/BaxBax/Bcl-2badBad/Bcl-2Bad/Bcl-xLbcl-xsBcl-xs/Bcl-2Bcl-xs/Bcl-xLMcl-1Mcl-1/bcl-xLMcl-1/Bcl-2Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了‘Bax/Bax’诱导凋亡的作用。即Bax和Bcl-2比值调节凋亡；当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2，使Bax/Bax形式保存，诱导细胞凋亡。PossibleModeofbcl-2Action一、凋亡的形态学检查〔光镜、电镜〕1苏木素—伊红〔HE〕染色法:应用范围：石蜡组织切片、细胞涂片结果判断：正常细胞保持原生长形状，梭形或多角形；细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡黄色。凋亡细胞表现为核染色致密浓缩、核碎裂；凋亡细胞涂片可见凋亡小体。坏死细胞呈均质红染，无结构、核染色消失。2.甲基绿—派诺宁染色法:3.Giemsa染色法:4.瑞氏(Wright)染色法5.透射电子显微镜观察法二、荧光显微镜观察法Hoechst染色法〔一〕琼脂糖凝胶电泳法三、凋亡细胞的生化特征的检测Paclitaxel(mM)BCap37CellsMCF7CellsSusceptibilityofTumorCellstoPaclitaxel-inducedApoptosis5105010020051050100200Paclitaxel(mM)原理:ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶〔TdT〕或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸〔biotin-16-dUTP〕掺入到断裂的DNA的3’端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到细胞内是否存在DNA片段端存在。主要方法有2种:1.TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)2.DNA聚合酶I或klenow大片段介导的原位的缺口平移(ISNT)该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.ISNTandTUNELAssaysABDEFApApApApApACDApApApAp第六节细胞凋亡与临床疾病机体的生存取决于机体是否于平衡状态，而最重要的平衡是细胞数量的平衡，这种平衡又取决于细胞增殖与细胞凋亡〔及坏死〕。细胞凋亡是多细胞生物体内一个重要的生命现象，既可发生在个体发育过程和成体正常生理过程；亦可发生疾病发生开展过程。细胞凋亡的失调与许多疾病密切相关，包括肿瘤、神经变性、自身免疫、心脏疾病等。细胞凋亡与疾病细胞凋亡减少有关细胞凋亡增加有关1.癌症:淋巴癌P53突变所致癌依赖于激素引起的癌2.自身免疫性疾病红斑浓疮免疫介导的肾小管肾炎3.病毒感染疱疹病毒腺病毒痘病毒1.AIDS2.神经退行性