培养基的制备

第二章培养基的制备一、培养基：

是指供产生菌生长、繁殖、代谢和合成产品所需的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

培养基的必备条件？第一节基本概念1.

营养比较丰富，浓度要恰当：太营养菌体生长过盛，否则生长太差.2.

原料彼此不能产生化学反应：如柠檬酸，CaCO3

。返回

二、配制工业发酵培养基的一般要求3.

原料成本低，蛋白胨可用玉米浆，大豆粉代替。4.

不影响通气搅拌的效果，如蛋白质的含量高，泡沫多，通气差。

二、配制工业发酵培养基的一般要求第二节培养基的制备过程

一、培养基成分

（一）碳源功能：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体细胞成分所必需的碳成分为合成目的产物提供所需的碳成分

1、糖类：单、双、多糖。

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉等糖类物质，是细菌、放线菌、霉菌、酵母利用的碳源。其中，葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，几乎所有微生物都能利用葡萄糖。（葡糖效应和中期溶氧不足）其他糖类：蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖也是常用的碳源。多糖如淀粉和纤维素。淀粉还可以克服葡萄糖代谢过快的弊病，并且价格低廉，来源丰富。蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖常用于抗生素、氨基酸、酶类的发酵。

2、脂类：一般在糖类缺乏时，菌利用脂类。如植物油，动物油等脂类，具备较活跃的脂肪酶的微生物可利用脂类为碳源，但是耗氧量会增加，因此要提供更多的氧。常用脂类有：豆油、菜油、葵花籽油、棉籽油、玉米油、猪油等

3、有机酸，醇：柠檬酸，甲醇。碳氢化合物：石油产品，如谷氨酸生产菌，用正十六烷作碳源，当发酵到100小时加适量青霉素，谷氨酸产量达84g/L。碳源可分为速效碳和缓效碳，要配合使用。（二）氮源

功能：氮源物质构成菌体细胞结构物质（氨基酸、蛋白质、核酸）；为微生物提供能源；合成含氮的代谢产物。常用的氮源分为两类：无机氮源和有机氮源。鱼粉酒糟1.无机氮源主要包括氨水、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等。其被利用速度及吸收速度均快于有机氮源，也被称为速效氮源。一般情况下作为辅佐氮源。生理酸性氮源和生理碱性氮源常被用来做发酵过程中培养基pH调节的一种有效手段。2.有机氮源

主要成分复杂的工农业下脚料，包括豆粉、玉米粉、豆饼、鱼粉、蚕蛹粉、酿酒工业的酒糟等。含有机氮源的培养集中，菌体生长速度快，菌丝较多。

玉米浆：一般含10%左右的乳酸，pH值在4左右，一般用于抗生素发酵。尿素（脲）：抗生素和氨基酸发酵，尤其是谷氨酸的生产。能分泌脲酶的微生物才能利用。氮含量高达50%，但是营养成分单一。蛋白胨（动物组织和植物水解制备）：实验室用有机氮源（三）生长因子功能：生长因子为微生物必不可少的物质，一般为小分子有机物，需求量很小。包括：维生素、碱基等。维生素中需求量最大的为B族维生素，多为生化代谢中的辅酶。一般不需要单独添加。天然原料（玉米浆、糖蜜、豆饼水）及实验室培养基（酵母膏）等都已经含有。应用实例：生物素——合成生物质膜的重要辅酶，不足会造成细胞膜不完整，细胞内容物的渗漏。添加亚适量（5mg/L），可即使菌体生长少受抑制也可以使过多的谷氨酸因外泄而源源不断地合成。（四）无机盐及微量元素

功能：构成菌体的成分；酶的组成部分或其激活剂、抑制剂；调节渗透压、菌体内部pH以及氧化还原电位等等。大量元素（0.1～1mM），包括P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe，常常以盐的形式加入培养基。如：磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等。微量元素（0.01～

1mM），包括Cu、Zn、Mn、Mo和Co等，Co是发酵微生物

B12的激活剂。K,Na,Ca等离子虽然不是细胞的组成成分，但是与维持细胞的一定渗透压和细胞透性相关，并且是许多酶的激活剂。（五）前体在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质称前体。

最早是从青霉素的生产中被发现的。加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml；玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。发酵过程中所用的一些前体物质产物前体产物前体青霉素G青霉素V金霉素灰黄霉素红霉素苯乙酸及其衍生物苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇核黄素类胡萝卜素L-异亮氨酸L-色氨酸L－丝氨酸丙酸盐β－紫罗酮α－氨基丁酸邻氨基苯甲酸甘氨酸（六）促进剂和抑制剂1、促进剂：并不是前体或营养物质，但却能提高产量的物质。

作用方式：或影响微生物正常代谢；或促进中间产物的累积；或提高次级代谢产物量。如：巴比妥盐能增加生产菌菌丝的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶目的，增加链霉素和利福霉素等抗生素的累积。如：谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸的时候，加入红霉素可以提高产量25%以上，加入表面活性剂可以增加产量30%以上。促进剂能促进产量增加的原因：主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。

2、抑制剂：一些对生产菌代谢途径有某种调节能力的物质。抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一个代谢途径，之一改变代谢途径，如：酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以促进酒精发酵转入甘油发酵。淘汰杂菌的抑制剂，如：真菌发酵中加入抗生素；带抗生素抗性的工程菌发酵中加入该抗生素，淘汰非重组细胞或突变细胞。

（七）水份（1）水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2）渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的（运输）；（3）水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4）水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5）水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。（八）消泡（沫）剂消沫剂：工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫。有植物油脂和一些高分子化合物。有机消泡剂

有机硅消泡剂

聚醚型消泡剂二、培养基类型（一）按组成分合成培养基：用于研究、育种天然培养基：用于工业生产半合成培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（二）按状态分固体液体半固体（三）按用途分1、孢子培养基2、种子培养机3、发酵培养基孢子培养基：供菌种繁殖孢子，常采用固体培养基，目的是在使发酵菌种不发生变异的前体下尽可能多的产生孢子。基本要求：①营养不要太丰富（特别是有机氮源）。②无机盐浓度要适当。

生产上常用的有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基等。种子培养基：供孢子发芽生长出大量的菌丝体。要求：

①

丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子；

②碳源和氮源应易于利用，磷酸盐、维生素含量稍高。

③与发酵培养基的主要成分相近，使种子尽快适应发酵培养基，缩短周期。发酵培养基：供菌种生长繁殖和合成发酵产物的培养基。要求：①组成丰富，多迟效营养，少速效营养；②适当的碳氮比、缓冲剂、前体、促进剂；③便于发酵控制及产物提取纯化。

孢子培养基（%

）：淀粉

0.8K2HPO40.05天冬氨酸

0.002CaCO30.1麸皮

2KNO30.1琼脂

1.8MgSO40.05pH7.5NaCl0.05庆大霉素生产摇瓶培养基（%）：

淀粉

5.5（NH4）2SO40.05葡萄糖

0.5CaCO30.5黄豆粉

4KN030.05蛋白胨

0.3油少量

庆大霉素生产发酵培养基（%）：淀粉

1.5（NH4)2S040.05蛋白胨

0.5CaCO30.5黄豆粉

3KNO30.05玉米粉

1庆大霉素生产三、培养基的选择（一）原则1、根据微生物特点选择组成2、根据培养基用途选择状态3、根据培养目的选择成分配比4、根据经济效益选择原料（二）大规模生产用培养基应符合的要求：

P24四、工业发酵培养基的制备工艺及生产操作过程（一）培养基设计原则1、营养物质满足微生物生长需要。2、营养物质浓度及配比适当。3、PH、渗透压等理化条件适宜。4、根据培养目的设计配制。5、原料来源广泛、价格合理。提倡就地取材，以粗代精，以废代好。二、液体培养及制备工艺1、淀粉的组成和特性（1）淀粉颗粒的外观淀粉颗粒呈白色，不溶于冷水和有机溶剂，其内部呈复杂的结晶组织。随原料品种和种类的不同，淀粉颗粒具有不同的形状和大小。形状不规则，大致上可分为圆形、椭圆形和多角形。

偏光显微镜下淀粉颗粒的偏光十字(×400倍)显微镜下淀粉颗粒结构板栗淀粉粒（一）淀粉质水解糖的制备方法籼米淀粉粒偏光显微镜下淀粉颗粒的偏光十字(×400倍)显微镜下淀粉颗粒结构薏米淀粉粒（2）淀粉分子的组成淀粉的本质是由葡萄糖脱水聚合而成的，可以表示为（C6H10O5）n。可分为直连淀粉和支链淀粉，直链淀粉通过α-1，4键连接。支链淀粉的直链部分通过α-1，4键连接，分支点则有α-1，6键连接。

支链淀粉淀粉分子颗粒构成过程：淀粉分子链针状晶体淀粉颗粒氢键聚集（3）淀粉的理化性质淀粉一般呈白色粉末状，在热水中能溶胀。纯支链淀粉能溶于冷水中，而直链淀粉不能，直链淀粉能溶于热水。淀粉没有还原性，也没有甜味，不溶于冷水、也不溶于酒精、乙醚等有机溶剂。糊化：淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉颗粒破裂，淀粉分子溶于水中形成一种均一的糊状胶体溶液，这就是糊化。溶解或液化：淀粉糊化后，如果提高温度至130℃，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的粘度迅速下降，变为流动性较好的醪液，这种现象称为淀粉的溶解或液化。

2、淀粉水解的原理（1）淀粉的水解反应淀粉糖化中的主要反应，本质是α-1，4键和α-1，6键被打开，分子量逐渐减小，糖苷键的断裂是随机的。反应趋势是：淀粉→糊精→低聚糖→葡萄糖。糊精：淀粉经酶法或化学方法水解得到的降解产物，为数个至数十个葡萄糖单位的寡糖和聚糖的混合物。

麦芽糖

(maltose)：两个葡萄糖分子以α-1，4-糖苷键连接构成的二糖。为淀粉经β淀粉酶作用下得到的产物。

（2）葡萄糖的复合反应葡糖在热和酸的情况下发生聚合反应，生成异麦芽糖、龙胆二糖等等，反应可逆，可经过再加酸水解一次来减少。（3）葡萄糖的分解反应葡糖发生的较弱的脱水反应，生成5-羟甲基糠醛，又进一步分解为乙酰丙酸、甲酸等，这些物质相互聚合，或与氨基酸聚合，生成有色物质。淀粉淀粉水解反应糊精水解反应麦芽糖葡萄糖复合反应分解反应复合二糖5-羟甲基糠醛低聚糖有机酸、有色物质图淀粉水解过程中发生的化学反应3、淀粉水解糖制备方法概述（1）酸解法（acidhydrolysismethod）是淀粉水解糖制备的传统方法，它是以无机酸（现在也用有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。

优点：工艺简单、水解时间短、设备生产能力大。目前广泛采用此法。

缺点：高温高压以及酸的腐蚀对设备有一定要求；副反应多，影响水解液质量；对原料要求严格，原料淀粉颗粒必须大小均匀，否则造成水解不均一不彻底；废水难处理。（2）酶解法（enzymehydrolysismethod）是用专一性很强的淀粉酶将原料淀粉水解为糊精和低聚糖，在用糖化酶继续水解为葡糖的制糖工艺。酶解法一般分为两步进行：液化（liquification）和糖化（saccharification），因为都用到酶，所以又称双酶水解法（double-enzymehydrolysismethod）。优点：条件温和，设备要求低；酶专一性强，副反应少；淀粉液初始浓度较高，要求较低（颗粒大小可以不均一）；糖液颜色浅，较纯净。缺点：生产周期长（常需要数十个小时），需要专门设备（如培养酶的设备），过滤困难（酶是蛋白质）。但随着酶制剂工业的发展，酶法取代酸法是淀粉水解糖技术发张的必然趋势。（3）酸酶结合法：是结合了酸法和酶法的水解糖制备工艺，兼具两者特点。又可分为酸酶法和酶酸法两种。酸酶法：先将淀粉用酸水解成低聚糖和糊精，在用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。有些原料的淀粉，如玉米、小麦的淀粉颗粒坚实，用α-淀粉酶短时间内往往作用不彻底，因此有些工厂就先用酸将淀粉水解到一定程度（DE值约为15），再用糖化酶糖化，解决了这一问题。酶酸法：是先用α-淀粉酶将原料淀粉水解到一定程度，过滤除去杂志后，再用酸完全水解的工艺。该法适用于较粗的原料，如大米淀粉，可以弥补酸法对原料要求较高的缺点，提高原料利用率。表

酸法和酶法制糖工艺比较比较项目酸法酶法葡萄糖值（DE值）9198淀粉原料浓度18%～21%34%～40%葡萄糖含量（干重）86%97%灰分1.6%0.1%蛋白质0.08%0.1%5-羟甲基糠醛0.3%0.003%色度10.00.2淀粉转化率90%98%工艺条件高温高压较温和过程能耗高低副产物多少生产周期短长设备规模小大设备生产能力大小设备要求耐高温高压，耐腐蚀不需耐高温高压，耐腐蚀葡萄糖收率较低较酸法高约10%4、淀粉酸水解法工艺流程（1）淀粉酸解法工艺流程：淀粉→调浆→过筛→加酸→进料→糖化→放料→冷却→中和→脱色→过滤→糖液中和：从糖化锅出来的糖化液是酸性的，淀粉浆的pH一般1.5左右，所以必须先中和，且中和可以通过等电点将蛋白质和氨基酸杂质去掉。一次中和pH：4.8~5.0，二次中和pH：6.7~7.0。用纯碱和烧碱中和，前者要避免产生泡沫，后者要边搅边加避免局部过碱产生焦糖。从糖化锅出来的糖化液温度很高（140～150℃），需先通过缓冲桶降温至70～80℃。脱色：除去对发酵过程和发酵产品不利的杂质和有色物质。有活性炭法、离子交换树脂法和新型磺化煤法。压滤：①温度适宜：过高使蛋白质等杂质沉淀不完全，过低糖液粘度过大，一般控制在60～70℃；②压滤机要定时出渣，防止滤布堵塞；③滤布保持清洁，经常清洗。（2）酸水解技术条件一般选择和原因：淀粉乳浓度18%～21%：浓度低，水解容易，糖液DE值高，质量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化质量下降但速度较快。一般精制淀粉乳的浓度可比粗制淀粉乳浓度选择高些。盐酸用量为干淀粉的0.5%～0.8%，使淀粉乳pH达到1.5左右：酸提供H+，是反应的催化剂，酸用量大，水解快，但副反应也强。进料压力0.02～0.03MPa；水解压力0.28～0.32MPa：淀粉水解的加热介质是水蒸气，由于糖化锅有专门管道不断排出不凝性气体，因此锅内充满水蒸气，其温度和压力是正相关的。工业上一般控制压力，压力低水解慢，压力高虽然水解快，但副反应也快，并且锅体腐蚀也快。水解时间一般15min左右：糖化锅容积不能太大，保证进料放料迅速，保证在有效的时间内蒸汽能均匀地作用于底物，避免水解不彻底，且尽量避免副反应；糖化锅附属管道设计也应尽量保证缩短辅助时间。水解终点检查，一般用无水酒精检查无白色反应为止。图典型糖化锅构造1、原料淀粉进口1；2、热水进口；3、搅拌器；4、加热蒸汽管道进口；5、蒸汽冷凝水出口；6、糖化液放料口；7、不凝性气体排出口；8耳架；9、原料淀粉进料口2；10、环形槽；11、污水排出口；12、风门（3）淀粉酸水解过程中的一些因素淀粉乳浓度：浓度低，水解容易，糖液DE值高，质量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化质量下降但速度较快。一般精制淀粉乳的浓度可比粗制淀粉乳浓度选择高些。酸的种类和浓度的影响：酸提供H+，是反应的催化剂，酸用量大，水解快，但副反应也强。①盐酸：高效，但中和后产生氯化物，增加糖液灰分，对葡萄糖的结晶，分离及收率会有影响。②硫酸：能力仅次于盐酸，用碳酸钙中和，经脱色，离子交换可除去。③草酸：能力低，用石灰中和生成草酸钙，脱色过滤易除去，非强酸，减少了复合反应。糖化温度和时间：淀粉水解的加热介质是水蒸气，由于糖化锅有专门管道不断排出不凝性气体，因此锅内充满水蒸气，其温度和压力是正相关的。工业上一般控制压力，压力低水解慢，压力高虽然水解快，但副反应也快，并且锅体腐蚀也快。5、淀粉酶水解法工艺流程酶法主要用到α-淀粉酶和糖化酶两种酶，因此又叫双酶水解法。淀粉酶解法工艺流程：液化→糖化→灭酶→过滤→贮糖计量→发酵（1）液化：定义：双酶水解法的第一个步骤，使用α-淀粉酶的催化作用水解原料淀粉，使淀粉液黏度不断下降，流动性增强的过程。国内一般使用的α-淀粉酶来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），作用于α-1,4糖苷键，可越过α-1,6糖苷键作用于直连淀粉和支链淀粉，主要产物是麦芽糖和葡萄糖。工艺要点：

淀粉状态：淀粉在液化前必须先糊化，破坏其晶体结构，使淀粉分子浸出，再加入α-淀粉酶。酶只在淀粉颗粒表面反应，淀粉颗粒的水解速度和淀粉糊化液的水解速度之比为1:20000。

温度：目前α-淀粉酶的最适作用温度为40℃。但生产上为尽快完成液化，一般温度为80～90℃，并加入钙离子作为保护剂。研究耐高温的α-淀粉酶是双酶水解法的热点问题。

pH值：α-淀粉酶在pH6.0～7.0稳定，最适pH为6.2～7.4。但也与温度有关系。

其他因素：淀粉乳中的淀粉和糊精本身对酶有保护作用；α-淀粉酶是金属酶，活性依赖钙离子；酶的用量，这依淀粉酶的活力和原料而定。

液化程度的控制：酶法液化虽然副产物少，但时间较长以后也会使产物重新结合成大分子（类似淀粉糊化时间过长引起的淀粉老化现象），影响下一步糖化。因此一般液化时间控制在10～15min，DE值10～20即可。用碘液显色法控制液化终点(见下表)。葡萄糖聚合度与碘液呈色最高吸收波长（nm）7～8无色48016淡红色51021红色54028红紫色56034紫色58041兰紫色60061兰色620120兰色630330兰色630葡萄糖聚合度与碘液的呈色表（2）糖化：定