《重组蛋白表达体系》课件

《重组蛋白表达体系》PPT课件目录重组蛋白表达体系概述重组蛋白表达体系的构建重组蛋白的表达重组蛋白的分离与纯化重组蛋白的表达影响因素重组蛋白表达体系的优化01重组蛋白表达体系概述Part重组蛋白表达体系的建立需要经过基因克隆、载体构建、宿主细胞转化、目的蛋白质表达及纯化等步骤。重组蛋白表达体系具有高效、可调控、可大规模生产等优点，是现代生物技术领域中的重要技术手段。重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术，将外源基因在宿主细胞中进行表达，从而获得目的蛋白质的过程。重组蛋白表达体系的基本概念以大肠杆菌为代表的原核生物作为宿主细胞，具有操作简便、成本低廉等优点，适用于表达结构简单、易于纯化的蛋白质。原核表达体系以酵母、昆虫和哺乳动物细胞等为代表的真核生物作为宿主细胞，适用于表达复杂结构、功能多样的蛋白质，但操作复杂、成本较高。真核表达体系通过基因工程技术手段，在宿主细胞中引入特定的转录后修饰系统，使目的蛋白质具有与天然蛋白质相同的修饰，如磷酸化、糖基化等。转录后修饰体系重组蛋白表达体系的种类重组蛋白表达体系的应用生物医药领域用于生产药物、疫苗、诊断试剂等，提高产量、降低生产成本。农业领域用于改良农作物性状、生产转基因食品等，提高产量、抗病抗虫等。工业领域用于生产酶、蛋白质等生物催化剂和工业原料，提高生产效率、降低环境污染。02重组蛋白表达体系的构建Part通过分子生物学技术，从生物体中分离出目的基因的DNA片段。基因克隆如果目的基因无法从生物体中直接获得，可以通过人工合成的方法获得。基因合成目的基因的获取质粒是一种环状DNA分子，可以自我复制并稳定地存在于宿主细胞中。病毒载体可以将目的基因插入到病毒基因组中，并利用病毒的复制机制在宿主细胞中表达目的基因。载体的选择与构建病毒载体质粒载体限制性酶切使用限制性酶对目的基因和载体进行酶切，产生黏性末端或平末端。连接反应将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成重组分子。目的基因与载体的连接重组质粒的转化与筛选转化将重组质粒导入到宿主细胞中，常用的方法有电穿孔法和化学转化法。筛选通过特定的筛选标记对转化子进行筛选，如抗生素抗性标记、报告基因等。03重组蛋白的表达Part宿主细胞选择根据重组蛋白的特性选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。宿主细胞培养培养宿主细胞，使其达到适合重组蛋白表达的状态，包括调整培养基成分、控制培养温度和pH等。宿主细胞的选择与培养VS根据选用的宿主细胞和重组蛋白特性，选择适当的诱导方法，如添加诱导剂、改变温度或pH等。表达水平通过优化诱导条件，提高重组蛋白的表达水平，确保获得足量的目标蛋白。诱导方法重组蛋白的表达诱导采用适当的检测方法，如Westernblot、ELISA等，对重组蛋白的表达进行定性或定量分析。对表达产物进行纯化，去除杂质，获得高纯度的目标蛋白，以便后续研究或应用。检测方法表达产物纯化重组蛋白的表达检测04重组蛋白的分离与纯化Part通过物理或化学方法破碎细胞，释放细胞内表达的重组蛋白。细胞破碎利用离心机将破碎的细胞碎片与上清液中的重组蛋白进行分离。离心分离细胞破碎与离心分离蛋白质的沉淀与萃取通过改变溶液的pH、离子强度或添加有机溶剂等手段，使重组蛋白从溶液中沉淀下来。沉淀利用不同物质在两种不相溶溶剂中的溶解度差异，将重组蛋白从一种溶剂转移到另一种溶剂中。萃取凝胶过滤层析利用不同大小的蛋白质在凝胶上的扩散速度不同进行分离。要点一要点二离子交换层析利用蛋白质的电荷性质差异进行分离，常用于去除杂质和纯化目的蛋白。蛋白质的层析分离聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质的大小和电荷性质进行分离。等电聚焦电泳根据蛋白质的等电点进行分离，常用于确定蛋白质的等电点并进一步纯化。蛋白质的电泳纯化05重组蛋白的表达影响因素Part03宿主细胞的生长条件宿主细胞的生长条件如温度、pH、培养基成分等对重组蛋白的表达也有影响。01宿主细胞的遗传背景不同的宿主细胞具有不同的基因组背景，对重组蛋白的表达有显著影响。02宿主细胞的代谢状态宿主细胞的代谢状态影响其能量和物质供给，从而影响重组蛋白的表达。宿主细胞的影响123某些蛋白酶可能对重组蛋白产生降解作用，影响其稳定性。蛋白酶的稳定性重组蛋白的构象稳定性对其表达和功能有重要影响。蛋白构象的稳定性重组蛋白与其他细胞成分的相互作用可能影响其稳定性。蛋白与其他分子的相互作用重组蛋白的稳定性表达载体和宿主细胞选择选择合适的表达载体和宿主细胞可以提高重组蛋白的表达量。诱导条件的选择选择适当的诱导条件如诱导剂浓度、诱导时机等可以影响重组蛋白的表达量。基因设计和优化基因序列的优化和改造可以显著提高重组蛋白的表达量。重组蛋白的表达量06重组蛋白表达体系的优化Part基因敲除通过基因敲除技术，去除宿主细胞中与重组蛋白表达相关的内源性基因，减少内源性蛋白的干扰。基因突变通过基因突变技术，对宿主细胞中与重组蛋白表达相关的基因进行突变，以提高重组蛋白的表达水平。基因扩增通过基因扩增技术，增加宿主细胞中与重组蛋白表达相关的基因拷贝数，提高重组蛋白的表达量。宿主细胞的遗传改造培养基成分01优化培养基的成分，如添加适量的氨基酸、维生素和微量元素等，以促进重组蛋白的表达。温度和pH值02调整培养温度和pH值，以适应重组蛋白的表达需求，提高表达效率。诱导剂浓度和添加时间03优化诱导剂的浓度和添加时间，以最大化重组蛋白的表达量。表达诱导条件的优化STEP01STEP02STEP03蛋白质纯化方法的改进亲和标签采用多步纯化方法