限制性内切酶的应用

限制性内切酶的应用病毒免疫室编辑ppt限制性内切酶的发现30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制〞病毒生存的方法那么可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶编辑ppt限制性内切酶的特点限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII〔157个氨基酸〕，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。编辑ppt限制性内切酶的主要功能

保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一局部行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大局部病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。

编辑ppt限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶〔甲基化酶〕出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏限制性内切酶和它的"伙伴"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰〔R-M〕系统。在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行编辑ppt限制性内切酶的命名限制性内切酶命名的次序如下：A〕用3个字母代表来源的生物〔如Bam代表Bacillusamyloliquefaciens〕B〕1个字母或阿拉伯数字代表菌株〔BamH〕C〕1个罗马字母代表发现或鉴定的次序〔BamHI〕编辑ppt限制性内切酶的分类按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类

I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备实用性。编辑ppt限制性内切酶的分类II型酶在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。编辑ppt限制性内切酶的分类

III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。编辑pptII型限制性内切酶的分类〔一〕内切酶中最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要局部。大局部这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列〔如EcoRI识别GAATTC〕；而另一些识别不连续的序列〔如BglI识别GCCNNNNNGGC〕。限制性内切酶的切割后产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶那么需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。编辑pptII型限制性内切酶的分类〔二〕IIS型酶，比方FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。编辑pptII型限制性内切酶的分类〔三〕第三种II型限制性内切酶〔有时也被称为IV型限制性内切酶〕是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列〔如BcgI：CGANNNNNNTGC〕，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。编辑ppt一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力编辑ppt同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差异只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种那么不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，那么只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶〔同切酶或异源同工酶〕。

同裂酶和同尾酶：编辑ppt有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC〕、SpeⅠ(A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG〞粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即BfaⅠ〔C`TAG)的酶切位点。同尾酶：编辑ppt限制性内切酶的应用克隆〔有时与甲基化酶联用〕鉴定〔基因片断大小、正反向〕检测突变〔识别位点，限制酶切图谱的多态性〕制作Marker编辑ppt编辑ppt单酶切与双酶切的选择策略运用载体的限制载体的自身环化〔挑选阳性克隆的工作量〕克隆的方向〔鉴定〕编辑pptInsertEcoR1Xho11.9kb质粒编辑ppt该实验用质粒pCMV-Myc-T10经EcoRⅠ单酶切后应为5.7kb；用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后应产生两条DNA片段，一条是3.8kb，另一条是1.9kb〔如以以下图〕。3.06.0EcoRIEcoRI&XhoIDNAMarker2.03.81.95.7编辑ppt

限制性片段长度多态性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)1987年，第一张较完整的人基因连锁图，500多个RELP位点，定位了Huntington病，CF〔囊性纤维化〕和癌相关基因〔APC，DCC等〕编辑pptRFLP在遗传病检测中的应用镰状细胞贫血症〔globin，6〕，其GAGGTG的突变，可用RFLP〔MstII，CCTNAGG〕或PCR-SSCP检出。甲型血友病〔FVIII－，XR〕可用PCR-RFLP检出。142bp99bp编辑ppt引起镰刀型红细胞贫血症的原因就是基因的点突变，即编码血红蛋白β肽链上一个决定谷氨酸的密码子GAA变成了GUA，使得β肽链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变。β肽链基因上单个核苷酸的替换A→U恰好使该根本片段丧失了可被MstII或CvnⅠ切开的一个限制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，用Southernblot分析方法和限制性片段长度多态性〔简称RFLP〕分析方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分析。编辑ppt编辑ppt0.5μg的1kbDNALadder0.8%TAE琼脂糖凝胶，EB染色

编辑ppt数据库限制性内切酶的数据库rebase.neb/rebase其中含有的所有限制性内切酶的完整表，包括识别的序列，甲基化的敏感性，商业信息和参考文献。编辑ppt应用中的注意点1、建立一个标准的酶切反响目前大多数研究者遵循一条规那么，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反响体系中，1μl的酶在1XBuffer终浓度及相应温度条件下反响1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果参加更多的酶，那么可相应缩短反响时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反响时间〔不超过16小时〕也可完全反响。一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比方，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。编辑ppt2、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44〔256〕个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46〔4096〕碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的〔3'或5'突出端〕，也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接编辑ppt3、加酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被参加到反响体系中〔在参加酶之前所有的其它反响物都应当已经加好并已预混合〕。酶的用量视在底物上的切割频率而定。编辑ppt4、DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素编辑ppt5、缓冲液对于每一种酶都提供相应的最正确缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最正确活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响编辑ppt6、反响体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反响体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反响比例可以由此确定。较小的反响体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%〔一般酶都贮存于50%的甘油中〕编辑ppt7、混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反响完全，必须使反响液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！编辑ppt8、反响温度大局部酶的反响温度为37℃；从嗜热菌中别离出来的内切酶那么要求更高的温度。一般为50-65℃不等编辑ppt9、反响时间1酶活单位的定义时间为1小时。如果参加的酶较多，可以相应地缩短反响时间；反之，如果参加的酶量较少，也可以延长时间以使反响到达完全编辑ppt10、终止反响如果不进行下一步酶切反响，可用终止液来终止反响。在NEB我们使用如下反响终止液：50%的甘油，50mMEDTA〔pH8.0〕，和0.05%溴酚蓝〔10μl/50μl反响液〕。如果要进行下一步酶切反响，可用热失活法终止反响〔65℃或85℃，20分钟〕。热失活并不能适用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反响。编辑ppt11、贮存大局部酶应贮存于-20℃。少局部酶那么须在-70℃长期保存。10XBUFFER和100XBSA于-20℃保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否那么将会出现BSA沉淀编辑ppt12、稳定性每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。大局部酶在推荐的保存缓冲液里在-20℃条件下十分稳定。高于-20℃条件下稳定性将有所降低编辑ppt13、对照反响如果发现DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA〔待切底物〕与参加了内切酶的对照DNA〔有多个酶切位点〕同时进行反响。假设实验结果说明底物DNA降解，那么说明DNA在纯化过程中或反响液里引入了核酸酶污染；假设实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，那么可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反响，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在〔