第四章2食品生物技术

食品生物技术定义：生物技术是利用生物有机体（从微生物直至高等动植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种体系，是操纵生物（微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成、生物转化或生物降解，大规模地生产预期产品或达到特殊目的的一门技术。分类传统生物技术（包括通过微生物的初级发酵来生产商品或者由代谢控制发酵生产的食品）现代生物技术（以克隆技术的建立为标志）：酶工程、发酵工程、基因工程、细胞工程。制造

（醋）（面包）（奶酪）

（酒）（酸奶）及其它食品的传统工艺

（多糖）（维生素）

（乙醇）酶工程主要指天然酶制剂在工业上的大规模应用，主要包括：核酶非水相酶催化生物酶工程固定化和反应器的使用化学酶工程发酵生产与分离纯化4.5.1酶工程为实现酶的大规模应用，需制备大量的酶。目前，获得酶的途径有两条：一是化学合成，即通过化学方法人工合成酶蛋白；另一种途径是利用生物技术通过微生物细胞发酵或植物和动物细胞的生命活动，生产人们所需要的酶，即酶的发酵生产。发酵生产：一般的酶都采用微生物细胞来发酵生产，这是因为微生物具有种类多、繁殖快、容易培养、代谢能力强等特点。酶发酵生产的一般工艺流程如图所示。主要包括原料选择、菌种选育和发酵。发酵生产的酶必须经过分离纯化，才能进行后续研究或使用。酶纯化包括以下步骤：除杂，即将酶提取液中杂蛋白以及其他大分子物质除去；浓缩，即提高目标酶的浓度；结晶，酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段。图示：保藏细胞

细胞活化

原生质体细胞扩大培养固定化细胞

固定化原生质体预培养

培养基发酵无菌空气

分离纯化

酶4.5.5.1酶的固定化技术产生背景：在使用过程中，人们注意到酶的一些不足之处：酶的稳定性较差，易受外界影响而变性失活，难以回收利用，难以连续化生产等。基于克服上述缺点，酶的固定化技术发展起来。定义：酶的固定化是指采用适当的方法使游离酶被固定而酶活不受影响。优势：酶固定化后一般稳定性增加，能连续进行催化反应，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复回收使用多次，便于运输和贮存，有利于自动化生产。4.5.1.1酶的固定化技术主要内容：1）酶固定化方法2）细胞的固定化（在固定化酶基础上发展起来的一门技术）3）固定化酶（细胞）的优缺点4）固定化酶的评价指标5）酶反应器（类型、特点、选择）6）固定化酶（细胞）在食品工业中的应用1)酶固定化方法：A.吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。B.包埋法包埋法是将酶分子截留在具有特定网络结构载体中的一种固定化方法。包埋法可以分为凝胶包埋法、纤维包埋法、辐射包埋法和半透膜包埋法等。C.共价结合法共价结合法是通过酶分子表面的功能基团与载体表面的功能基团发生化学反应形成共价键而实现结合的一种固定化方法，在实际中应用最多。D.交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成网络结构的酶固定化方法称为交联法。最常用的双功能试剂是戊二醛。根据有无惰性载体的参与，交联法可以分为共交联法（有载体）和交联酶法（无载体）。根据无载体固定化酶制备的形式，可以分为以下几种：（1）交联溶解酶（2）交联酶结晶（交联的对象是酶结晶）（3）交联酶聚集体（采用物理方法使酶分子聚集，再经交联剂交联而成不溶性酶聚集体）（4）交联喷雾干燥酶（对喷雾干燥的酶颗粒进行交联而获得的酶聚集体）2）细胞的固定化固定细胞是将具有一定生理功能的生物细胞，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。A.固定化细胞的分类、形态特征和生理状态分类：按其细胞类型有固定化微生物、植物、动物细胞三大类；按其生理状态可分为固定化细胞核活细胞两大类。形态特征：由于用途和制备方法不同，可以使颗粒状、块状、条状或不规则状等，其中多为球形颗粒。生理状态：固定化死细胞（适于单酶催化反应）和固定化活细胞B.细胞固定化方法a.吸附法b.包埋法c.共价交联法d.无载体固定化有两种形式，一是直接利用胞内酶而选择适当的物理或化学因素处理细胞，使酶固定在细胞内。另一种形式是依赖细胞自身的相互作用或絮凝作用及自聚集倾向制备固定化细胞。3）固定化酶（细胞）的优缺点固定化酶的优点：（1）极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应，有利于工艺的连续化、管道化。（3）酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。（4）在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。（5）较能适应于多酶反应。（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。固定化酶的缺点：（1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本，使工厂初始投资大。（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。（3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。固定化细胞的优点：（1）使用固定化细胞省去了酶的分离过程，可显著降低生产成本。（2）固定化细胞多为多酶系统，无需辅因子再生。（3）固定化细胞对不利环境的耐受性增加，可重复使用。（4）保持了胞内酶系的原始状态，因而更稳定。（5）固定化细胞密度大、可增殖，因而缩短了发酵生产周期、提高了生产能力。固定化细胞技术的局限性：（1）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在会形成不需要的副产物。（2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。（3）载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性等。4）固定化酶的评价指标指标评价固定化酶的活力相对活力偶联率固定化酶的半衰期A.固定化酶的活力是固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可以在一定条件下所催化的某一反应初速率来表示，表示为μmol/（min·mg)测定方法分为间歇测定和连续测定。B.偶联率及相对活力的测定偶联率=（加入蛋白质活力-上清液蛋白质活力）/加入蛋白质活力×100℅活力回收=固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力）×100℅偶联率=1时，表示反应控制的好，酶失活不明显。C.固定化酶（细胞）的半衰期固定化酶（细胞）的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。在没有扩散限制时，固定化酶活力随时间呈指数关系。t1/2=0.693/KD式中，KD=-2.303·lg(E0/E),KD称为衰减常数，括号中E0/E是时间t后酶活力残留的百分数。5）酶反应器用于酶进行催化反应的装置称为酶反应器。图示：（1）搅拌罐式反应器特点：结构简单，内容物混合充分均匀，易控制温度和PH，传质阻力低，能处理胶态底物及不溶性底物。缺点：游离酶不能回收重复使用，一般通过加热等方法使酶失活以终止酶反应。在搅拌反应过程中以及采用离心或过滤方法回收过程中，固定化酶易破损而造成酶的损失。（2）固定床式反应器只能用于固定化酶的催化反应。酶反应器有哪些类型和特点呢？优点：单位体积中所含酶的量较多，催化效率高。反应产生的产物从反应器中不断流出，可减少产物抑制。缺点：该反应器存在只适用于可溶性底物，且难以控制PH和温度。（3）流化床反应器适用于较小颗粒固定化酶进行连续催化反应的反应器优点：混合均匀，传质传热效果好，容易控制温度和PH，压力降较小，不易堵塞，能处理黏度较高的反应液。缺点：固定化酶在使用过程中始终处于悬浮翻动状态，易导致结构破坏。（4）鼓泡式反应器当酶反应过程中有气体参与或产生时，可采用此反应器。原理：将酶置于反应器中，底物溶液和气体从反应器底部进入，气体产生大量气泡，气泡在上升过程中起到提供反应底物和混合作用，使酶和反应液在保持混合均匀的状态下进行反应。特点：借助气体的鼓泡作用即可达到反应体系的混合效果，也可提供酶反应所需的气体底物，另外还可以降低或消除挥发性产物对酶的抑制作用。（5）膜式反应器优点：游离酶膜反应器可以解决游离

酶的回收使用，降低成本，压降小，

设备放大容易缺点：反应器中单位体积内催化剂的

有效面积小，制造成本高。反应容器膜分离器超滤膜产物底物溶液酶液循环利用（6）喷射式反应器原理：利用高压蒸汽的喷射作用实现

酶与底物的混合，进行高温短时催化。优点：结构简单，体积小，物料混合

效果好，温度高，反应快，效率高。适用于游离酶的连续催化反应。缺点：只能用于那些耐高温酶的催化反应，酶一般不能回收利用。B.酶反应器的选择在实际应用中，应根据酶、底物和产物特性以及操作要求的不同来进行选择。酶和底物溶液反应液高压蒸汽至维持罐（1）根据酶的应用形式选择酶反应器。（2）根据酶反应动力学性质选择酶反应器从酶与底物的混合程度考虑搅拌罐式、流化床式和鼓泡式反应器混合效果较好。固定床式和膜式较差。搅拌罐式、鼓泡式、膜式、喷射式固定化酶游离酶催化搅拌罐式、固定床式、流化床式、鼓泡式、膜式HOWTOCHOOSE?对于具有高浓度底物抑制作用的游离酶，可以选用分批搅拌罐式反应器，采用流加操作方式进行；也可选用游离酶膜式反应器，控制底物浓度进行反应。对于具有高浓度底物抑制作用的固定化酶，可以选用连续搅拌罐式反应器、固定床式、流化床式和膜式反应器。对于有产物抑制作用的游离酶，可以选用游离膜式反应器。对于有产物抑制作用的固定化酶，可以选用固定床式反应器。有些酶需要在高温下进行反应，则最好选用喷射式反应器。（3）根据底物或产物得理化性质选择酶反应器颗粒状底物和黏度较高的胶体底物，应当选择搅拌罐式反应器和流化床反应器，而不宜采用固定床式和膜式反应器。6）固定化酶（细胞）在食品工业中的应用（1）在制糖工业上的应用固定化葡萄糖异构酶可以用来催化玉米糖浆和淀粉，生产高甜度的高果糖糖浆。固定化技术还广泛应用于制糖工业中的蔗糖转化和甜菜糖工业中的棉籽糖的水解。（2）在食品添加剂和配料中的应用。如低聚果糖、天冬氨酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷酸肽等的生产。如以富马酸为原料，天冬氨酸和L-苹果酸都可以采用固定化酶生产。（3）氨基酸的生产。例如，采用白明胶截留并用戊二醛处理L-氨基酸酰基转移酶用以生产L-氨基酸。（4）有机酸的生产。如利用戊二醛连接在胶原蛋白膜上固定Aspergillusniger细胞生产柠檬酸。（5）醇（酒）类的生产。例如，在制造啤酒时，可以试用固定化微生物淀粉酶替代麦芽水解淀粉酶。目前正在利用固定化木瓜酶和固定化多酚氧化酶研究解决啤酒的混浊问题。通常的酶催化反应是在以水为介质的系统中进行的，但水溶液中的酶催化反应在诸多方面呈现出不足和局限性。其实，酶在非水介质中也能进行催化反应。1984年，美国Klibanov在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述。这一发现为酶学研究和应用带来了又一次革命性飞跃。1）非水相酶的催化反应及其特征由于水对于酶的催化是必需的，因此在非水反应体系中需要有一定量的水存在。非水介质催化体系有机介质反应体系超临界流体反应体系气相介质反应体系离子液介质反应体系4.5.1.2非水相酶催化在有机介质中酶催化反应可以获得许多常规条件下不具有的新特征和优势：（1）可进行水不溶性化合物催化转化（2）改变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行，催化水解反应的酶可催化合成反应的进行。（3）由于酶在有机溶剂中结构上“刚性”的增加，对底物的专一性，包括区域专一性和对映体专一性大大提高，从而使实现对酶催化选择性有目的的调控称为可能。（4）酶的热稳定性大大提高。（5）由于酶不溶于大多数有机溶剂，反应后易于回收和重复利用。（6）可避免长期反应中微生物的污染。（7）减少或防止由水引起的副反应（8）可方便地利用对水分敏感的底物进行反应。（9）当使用挥发性溶剂作介质时，反应后的分离过程能耗降低。advantage2）有机介质中的酶促反应根据酶和水的分布特征可以将有机介质反应体系分为以下几种类型：（1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系。

酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。主要适用于在单一溶液中溶解度很低、反应速率也很慢的亲脂性底物的生物转化。（2）非极性有机溶剂-水两相体系

含有溶解酶的水相和一个非极性有机溶剂相所组成的两相体系。反应一般发生在水相或者两相的界面上，底物和产物在两相中的分配取决于溶剂、底物和产物得性质。

（3）非极性有机溶剂-酶悬浮体系

酶悬浮于有机相中。底物分子以扩散形式通过酶分子表面的水层进入活性中心，完成催化后进入有机相。（4）非极性有机溶剂-PEG修饰酶单相体系。聚乙二醇（PEG）具有亲水和疏水两种特性，用PEG修饰酶分子的赖氨酸残基，使酶反应的整个体系处于一种均相状态，同时为酶分子表面创造了一个亲水的微环境。（5）反胶束体系。反胶束是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的聚集体，表面活性剂分子的极性一端朝内，而非极性一端朝外与有机溶剂接触。酶分子在反胶束形成的微型水囊内。3）有机介质中酶的性质（1）有机介质体系中酶活性的变化。一般来说酶在有机溶剂中的活性比在水溶液里要低很多。（2）酶的稳定性变化。酶在有机介质中的热稳定性、储存稳定性以及对变性剂的耐受性显著提高。（3）PH记忆和分子印迹。PH记忆是指有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或沉淀前所在缓冲液PH时的状态。在对枯草杆菌蛋白酶的研究中发现，竞争性抑制剂导致的酶构象变化在除去抑制剂后在低水条件下仍能保持。这种酶分子记忆原来在水相中的一些特征的现象称为分子印迹。（4）底物专一性的改变。（5）反应平衡方向的移动。在有有机介质中进行酶促反应，有机溶剂可以明显改变反应的平衡，甚至可以使一些反应发生逆转。（6）酶促动力学变化。非水介质中酶的催化反应的速率一般要远低于水介质中的催化速率，最大反应速率一般也降低。4）气相和超临界介质的酶促反应在气相介质中酶以固态的形式存在，在气相催化系统中，不存在液相系统中存在酶的解决吸附问题。超临界流体除具有传统有机溶剂的所有优点外，还具有液体的高密度性、气体的高扩散性、低黏度和低表面张力等独特的优良特性。同时有高效的传质性能以及较高的底物溶解性。5）非水相酶催化在食品工业中的应用（1）功能性食品添加剂合成和转化方面的应用。如非水酶催化合成硬脂酸-L-抗坏血酸脂和植物甾醇脂肪酸脂。（2）香精香料合成转化方面的应用。以光明奶油为原料，以丙酮为溶剂，添加脂肪酶制备奶油香精，经感官评价，脂肪酶水解奶油奶香浓郁、持久，香韵丰富。（3）表面活性剂方面的应用。国内外的研究者以天然脂、合成三酰甘油或脂肪酸和甘油为原料，脂肪酶为催化剂，通过多种反应途径在不同的反应体系中合成了单酰甘油。定义：化学酶工程是由酶学与化学工程技术相互结合的产物，其研究通过固定化处理、化学修饰、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。本节主要介绍化学修饰酶、模拟酶、抗体酶、印迹酶的研究与应用。1）化学修饰酶通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子施行各种手术的技术，称为酶分子的化学修饰。酶分子化学修饰是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施。4.5.1.3化学酶工程（1）酶分子侧链基团的化学修饰。由于酶分子侧链上有各种不同的活泼功能团，这些活泼功能团与一些化学修饰剂发生反应，从而达到对酶分子进行化学修饰的目的。（2）酶分子表面化学修饰。可溶性的糖或糖衍生物、大分子多聚物和具有生物活动的大分子物质通过共价键将大分子连接到酶分子的表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶的性质发生改变。（3）辅因子修饰。利用化学方法在辅因子中接上一些其他集团，再将修饰后的辅因子取代天然酶的原有辅因子，便可以制造出多种多样的新型酶。酶经过修饰后，会产生各种变化：①提高生物活性；②增强不良环境中的稳定性；③针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；④产生新的催化能力。2）模拟酶模拟酶又称人工合成酶，是一类利用有机化学方法合成的比天然酶简单的非蛋白质分子。模拟酶分为以下几种：（1）环糊精模拟酶模型。由于环糊精的外缘亲水而内腔疏水，因而它能够像酶一样提供一个疏水的结合部位，作为主体包络各种适当的客体。并且环糊精分子能识别并捕捉一些匹配的底物分子，形成易溶于水的络合物，模拟了酶的识别作用。如果把类似于酶活性基团的小分子修饰到环糊精上，就可以模拟酶对有机化合物的催化水解、转氨基以及氧化还原作用等。（2）大环聚醚及其模拟酶。大环聚醚的结构类似于环糊精的空穴，可以对底物进行包络。冠醚及其含S.N大杂环类似物都具有选择性结合配体的能力，与酶的活性部位识别底物相似。（3）膜体系及其模拟酶。膜体系是由多个分子共同构成对底物有结合作用的空穴。胶束在水溶液中提供了疏水的微环境，类似于酶的结合位点，将催化基团和一些辅因子连接在胶束上，则提供了类似酶活动中心的催化部位，使胶束成为具有酶活力的模拟酶。3）抗体酶抗体酶是具有酶催化功能的抗体分子，本质为免疫球蛋白，但在可变区被赋予了酶的属性。它既具有抗体的高度选择性，又具有酶的高效催化效率。特点：抗体酶能催化一些天然酶不能催化的反应。多样性以及更高的专一性和稳定性。催化作用机制不同。4）印迹酶分子印迹就是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，这个化合物叫印迹分子。分子印迹技术包括如下过程：（1）选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；（2）在印迹分子-功能单体复合物周围发生聚合反应；（3）用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。形成的聚合物内保留有孔穴，类似于酶活性部位的空腔。利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基因，并与底物定向排列。选择印迹分子主要有：（1）印迹底物及其类似物。（2）印迹过渡态类似物。（3）表面印迹过渡态类似物。生物酶工程是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的一门新兴的学科；是利用蛋白质超分子结构知识，采用基因工程和蛋白质工程手段，对天然酶实施定向改造和体外分子操作。任务：①用DNA重组技术大量地生产酶（克隆酶）；②通过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶（突变酶）；③设计新的酶基因，合成自然界没有过的，性能稳定、催化效率高的新酶。1)酶基因的克隆和表达酶基因的克隆是指在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复制能力的DNA分子，即重组载体，然后通过转化或转染将重组载体导入宿主细胞并培养，并筛选出含有目的4.5.1.4生物酶工程

基因的转化细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基因。获得大量酶基因后，需要进行酶的异源表达。2）遗传修饰对酶分子进行遗传修饰的方法，主要包括酶的定点突变、酶分子定向进化以及定点突变与化学修饰结合法。（1）定点突变技术运用基因工程在弄清酶的一级结构和空间结构的基础上，设计出选择性遗传修饰位点，把一定位置上的氨基酸任意改变为另一种氨基酸。通过此技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。优点：突变效率高、简单易行、重复性好。缺点：高级结构基本不变，对功效改造有限。已有的结构与功能间关系的信息满足不了人们需求。（2）分子定向进化是在待进化蛋白质基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3ˊ→5ˊ校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比例向目的基因引入突变，构建突变库，凭借定向选择方法，选出所需性质的蛋白质。（3）定点突变与化学修饰结合法。先用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法修饰突变的氨基酸残基，即引入一个小分子化合物，得到一种化学修饰突变酶。3）融合酶融合酶主要是指将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白。在实际应用中主要表现在以下几个方面：①非催化特性的优化，融合酶的性质介于两者之间。②创造新催化活性酶，可分为三个级别：调整现有酶分子的特异性或催化特性；向结合蛋白引入催化部件；向蛋白质骨架引入结合部件和催化部件；③构建双催化活性的功能酶，把酶蛋白基因的末端相连。

4.5.1.5核酶核酶是具有生物催化功能的核酸，它的本质是核酸，但同时具有酶的特异性催化作用。核酶易于进行体外设计。核酶可以在特异性结合靶RNA或靶DNA，对遗传信息分子DNA和RNA具有封闭和切割双重作用，因而有“基因剪刀”之称。定义：发酵工程又称为微生物工程，是指传统的发酵技术与DNA重组、细胞融合、分子修饰等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。发酵工程主要是利用微生物的特定性状，通过现代发酵技术生产有用物质或直接用于工业化生产。目前人们利用微生物生产发酵产品可归纳为以下四个方面：（1）利用微生物菌体本身。获得菌体蛋白、进行生物防治、获得可食用大型真菌。（2）利用微生物的初级代谢功能。如白酒、啤酒、醋、酱、乳酪、赖氨酸等（3）利用微生物次级代谢功能。如抗生素、各种毒素、生物碱、维生素等（4）利用微生物合成大分子物质的功能，主要是酶的生产。4.5.2发酵工程本节主要内容：4.5.2.1菌种筛选与育种技术4.5.2.2培养基4.5.2.3发酵动力学4.5.2.4发酵过程优化4.5.2.5发酵工程在食品产业中的应用作为大规模生产的优良菌种，应尽可能满足下列要求：（1）菌种可在较短的发酵周期内产生大量具有价值的发酵产品的能力。（2）菌种能在廉价原料制作的发酵培养基上迅速生长并大量合成目的产物。（3）菌种对生长条件要求不高。（4）易于从发酵液中提取产物。（5）菌种生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染。（6）菌种不应该对人、动物、植物和环境造成危害。（7）菌种遗传特性稳定，不易退化，而且易于进行基因操作。4.5.2.1菌种筛选与育种技术1）菌种的分离和筛选A.利用目标特性的分离方法这种分离方法使利用所要分离的菌种具有某一特性作为菌种筛选的选择因子，设计一个富集培养的方法将需要的菌种迅速筛选出来。富集培养的原理是利用不同微生物间生命活动特点的不同制定特定的环境条件使得仅适用于该条件的微生物旺盛生长。B.不能利用目标特征的分离方法一些菌株的生理特性不能提供任何选择优势，很难直接筛选出来，就需要一个分离得到的微生物库用于某些目标特性的相关测定。separation下面有两种方法可能有助于解决这个问题：①设计能够筛选此类不常见微生物种类的方法；②将不能选择的具有工业用途的特性与可选择的特性联系起来，加快富集过程。C.筛选方法早起的筛选倾向于经验、密集的劳动，效率低。但是随着技术的发展，效率得到提高。突出表现在下述方面：（1）编码酶或受体的基因已被克隆用于抑制剂或增效剂的筛选，极大降低了成本，提高了效率。（2）受体基因分析技术的发展，使受体基因编码的产物可方便地用于测定相应序列编码的互补产物。（3）用于特殊基因序列的分子探针可以鉴定能产生特殊产物得菌株。（4）酶联免疫反应的大规模应用。（酶联免疫的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。）2）菌株的选育和改造菌株选育的目的是改良菌种特性，使其符合工业生产的要求。生产上广泛采用的自然选育、诱变育种属于经验育种范畴，主要通过突变和筛选来获得优良的菌株。杂交育种、分子育种是定向育种方法，分子育种主要是通过DNA重组来获得优良菌株。A.自然选育定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种自发突变进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。自然育种是一种简单易行的选育方法，但自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用。B.诱变育种定义：通过诱变剂处理可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，更有利于选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变的筛选和突变高产基因的表现。在菌种选育的同时，要重视培养基和发酵条件的研究，以保证突变菌株得到最佳的表现。C.杂交育种定义：杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过结合或原生质融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。原生质体融合是指用脱壁酶处理将微生物细胞除去制成原生质体，再用聚乙二醇（PFG）促进原生质体发生融合，从而获得异核体或重组子。通过原生质体融合能使来自不同菌株的多种优良性状，通过遗传重组组合到一个重组菌株里。D.分子育种分子育种是应用基因工程手段来进行的，基因工程是在分子水平上，根据需要用人工方法取得供体菌DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转入受体宿主，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状。利用基因工程技术将氨基酸合成酶基因克隆是提高氨基酸产量的有效途径。培养基必须满足微生物的基本需求。用于大规模生产时，配制的培养基应尽可能多的满足下列要求：（1）每克基质的产物或生物量的得率应最大（2）产物或生物量的浓度应最大。（3）产物得形成速率反应达到最大。（4）生成的副产物应最少。（5）质量稳定并且常年有供应。（6）培养基配制和灭菌时很少出问题。（7）在其他生产过程中尤其是通气、搅拌、提取、纯化和废物处理中很少出问题。4.5.2.2培养基1）培养基的组成成分A.工业上常用的碳源常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳醇等a.糖类（1）葡萄糖最容易利用的速效碳源，但过多使用亦不利。（2）糖蜜常用在酵母和丙酮、丁醇的生产中，抗生素等微生物工业也常用它作为碳源。（3）淀粉与糊精淀粉在发酵工业中被普遍使用。b.脂肪这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶。当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧。发酵中常用到的有豆油和菜油。

c.有机酸

一些微生物对许多有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙醇等）有很强的氧化能力，因此可以用其作为碳源。

d.影响碳源选择的因素

碳源的代谢速率会影响生物量的生成及初级产物或刺激产物得代谢。

发酵产品的价格主要由碳源决定。

培养基的制备方法，特别是灭菌方法，在不同的发酵过程中可能影响到碳水化合物的适用性。

B.工业上常用的氮源氮源的功能是构成菌体成分、作为酶的组成成分或维持酶的活性、调节渗透压、PH、氧化还原电位等。（1）无机氮源常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐等。微生物对无机氮源的吸收利用一般比有机氮源快，但无机氮源的迅速利用常会引起PH的变化。经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵。菌体代谢后能产生碱性物质的无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的PH有积极作用。（2）有机氮源常用的有机氮源有花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。C.无机盐及微量元素微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐和微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、铁、锰、锌和钴等，以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，在高浓度时则表现出明显的抑制作用。在培养基中，镁、磷、钾、硫、钙和氯常以盐的形式加入；而钴、铜、铁、锰、锌和铜等量需要少，并且许多原料含有，所以一般不需要单独加入。D.水水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体重要组成成分。对于发酵工厂来说，水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。E.生长因子定义：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质（如嘌呤、嘧啶、维生素、氨基酸等）均称为生长因子，其作用是构成细胞的组分，促进生命活动的正常进行。生长因子只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。有机氮源是生长因子的重要来源。如玉米浆，玉米浆中含有丰富的氨基酸、还原糖，磷、微量元素和生长素。F.前体定义：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物生物转化为产物分子，而此过程自身的结构并没有多大变化，但是产物得产量却因加入前体而有较大的提高。G.产物促进剂、诱导物和抑制剂在酶制剂、抗生素和氨基酸发酵生产过程中，可以在发酵培养基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂。工业上重要的酶都是诱导合成的。诱导酶的合成依赖于环境中诱导物的存在，诱导物通常是其底物。如淀粉或糊精是淀粉酶的诱导物。H.螯合剂许多培养基在配制或高压灭菌时会形成可见的不溶性金属磷酸盐沉淀。除去这种不可溶性金属磷酸盐主要通过添加低浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸和多聚磷酸盐。I.缓冲剂有些发酵生产对pH要求严格，可向培养基中加入某种化合物作为调节pH的缓冲物质，同时也可以作为营养物质。J.需氧量培养基可以用多种方式影响氧的供给，主要包括以下几个方面：（1）快速的新陈代谢。（2）流变学。（3）消泡剂。K.消泡剂在绝大多数微生物发酵过程中都面临到泡沫问题。泡沫形成最主要原因是由培养基中的蛋白质，这些蛋白质在气液界面处变形并形成一层不易破裂的薄膜。如果泡沫不加控制将会产生许多物理或生物学问题。泡沫的解决办法有以下三种：（1）改用合成培养基和改进某些物理参数（如pH、温度、通风和搅拌）。这个方法适用于泡沫的产生与培养基有关而与微生物代谢无关的情形。（2）使用消泡剂。（3）利用机械消泡。消泡剂应具有特定的性质，目前已被认可的有：①硬脂酸乙酯和辛脂醇；②脂类；③脂肪酸及其衍生物；④聚硅氧烷；⑤磺酸盐；⑥聚丙烯二醇等复合物。2）种子培养基用于发酵生产的种子必须健壮活跃，这样可以使随后发酵生产的延滞期缩至最短。要获得优良种子最主要的因素是选用合适的培养基。发酵培养基的设计不仅要满足生长需求，并且还要能够满足最大量合成产物的需要。细菌发酵生产用种子的扩大培养一般用液体培养基。而对于能形成孢子的微生物的发酵生产一般用产孢培养基。A.液体种子培养基培养基的糖分要少，氮源物质要相对多些，其中无机氮源所占比例要大些。B.产孢培养基（1）固体产孢培养基。很多真菌和链酶菌在合适的琼脂培养基上可以产生孢子。（2）液体产孢培养基。许多真菌在液体培养基中也可形成孢子，操作更方便。要形成丰富的孢子，氮的水平应该限制在0.05%～0.1%（m/V）。同时要维持良好的通风条件。3）发酵培养基的优化（1）碳源的筛选。在基础发酵培养基中分别加入不同碳源，以取代基础培养基中的葡萄糖进行碳源试验。以菌体或目的产物为指标来考量碳源的优劣从而选出最佳碳源。（2）氮源的筛选。类似于碳源的筛选，加入不同的有机氮和无机氮进行筛选，选出最佳氮源。还有生长因子的筛选以及其他的筛选。选定碳源、氮源以及相关因素后，然后对培养基进行量的优化，采用正交设计实验，选择合适的因素水平进行优化，确定最优化培养基。微生物群体生长的规律，根据培养方式可以分为分批培养、连续培养和补料培养三种类型。微生物生长的动力学主要研究细胞生长和发酵产物生成的速度及其关系以及环境条件对速度的影响。1）分批发酵与动力学A.微生物的生长曲线4.5.2.3发酵动力学B.微生物细胞生长动力学a.Monod方程与Herbert方程1942年，Monod首先提出生长速率与限制性营养物浓度的关系符合以下方程：μ=μmax[S]/(Ks+[S])μmax为微生物最大比生长速度；S为限制性营养物浓度；Ks为半饱和常数。Herbert方程式在Monod方程基础上，将内源代谢考虑到模型中。b.Logistic方程种群生长模型方程，假设细胞分裂是在一个空间和营养供应都无限制的环境中进行的：N(t)=N(0)en其中N为生物数量。c.Michaelis方程生物量的增长速率dX/dt是特定生长速率µ和生物量浓度X的成绩，即dX/dt=µX2）连续发酵与动力学连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。A.单机连续培养的动力学细胞的物料平衡：扩散速率D定义为体积流动速率F除以生物反应器内恒定的液体体积V,即D=F/V，与特定生长速率相等。限制性营养物的物料平衡流入的营养物-流出的营养物-生长消耗的营养物-维持生命需要的营养物-形成产物消耗的营养物=积累的营养物。连续培养的非结构模型：设反应罐体积为V，底物溶液的进料速率为F，料液中的底物浓度为C,体积为常数。体积不变化时，液体排出速率等于F。此时，单位体积中流向量：Φ=[-DXx,D(CS0-CS)]其中D=F/VB.多级连续培养由多个发酵罐串联组成，应用更广。C.连续培养的优缺点与应用优点包括以下四个方面：（1）提供了一个微生物在恒定状态下高速生长的环境，便于进行微生物代谢、生理生化和遗传特性研究。（2）生产能力高，产品质量稳定。（3）生产效率高。（4）便于自动化，成本低。缺点：（1）长时间培养易变异，并染上杂菌。（2）工业用培养基质量不稳定。（3）操作不当，新旧培养基不易完全混合。3)补料分批发酵与动力学定义：介于分批培养和连续培养之间的培养方法。在微生物或动植物细胞培养过程中，随着营养物质消耗，间歇或连续地添加营养成分或新鲜培养基，但不同时收获培养液。补料分批培养动力学：若补加的是浓缩底物，不引起培养溶液体积改变，则微生物的补料分批培养生长状态方程为

式中，μmax为微生物最大比生长速率；Cx为菌体浓度；Cs为底物浓度；Ks为半饱和常数；Ysx为得率常数。ms为维持常数。4.5.2.4发酵过程优化任何发酵生产都是在一定的生产环境下进行的，即一定的压力、温度、pH等。无论采用什么样的发酵方式，人们都要对发酵的各种参数（如溶解氧浓度、pH、温度、菌种与培养基的混合程度）进行严格控制，才能保证发酵正常进行。发酵过程优化的实质是生物反应器中的多水平问题研究。而且在微生物发酵过程中，各种参数（包括在线参数、离线参数、计算后的间接参数）间存在着错综复杂的相关性，并且随着代谢过程的进行而变化。各种参数间的相关性可分为理化相关、生物相关和综合相关。重视发酵过程细胞代谢流实时变化情况，获得代谢流分布动态变化的有关现象特征参数，便可实现发酵过程优化。optimization主要内容：1）溶解氧的影响与控制2）温度对菌体和发酵产物得影响3）pH的控制与优化4）发酵过程中补料的控制1）溶解氧的影响与控制好氧性微生物的生长发育和代谢活动都需要消耗氧气。不同的好氧微生物所含的氧化酶体系的种类和数量不同，在不同环境条件下，各种好氧微生物吸氧量或呼吸程度也不同。A.搅拌对溶解氧、氧吸收率的影响搅拌的作用是把气泡打碎，强化流体的湍流速度，使空气与发酵液充分混合，气液固三相更好地接触，增加溶氧速率，促进代谢产物的传质速率。搅拌器的相对位置对搅拌效果影响很大，从而影响溶氧系数。搅拌转速对溶氧水平和混合程度有很大影响。B.发酵罐内液柱的高度、发酵罐体积对溶解氧的影响一般在不增加功率消耗和空气流量不变时，增加发酵液的体积会使通风效率降低，特别是在通风量较小时尤为显著。但是在空气流量和单位发酵液体积消耗功率不变时，通风效率是随H/D的增加而增加，H/D为罐的高径比。发酵罐体积大有利于提高氧的利用率，体积小则利用率差。C.发酵液的物理性质对溶解氧的影响发酵过程中，大量繁殖的菌体和积累所产生的代谢产物等都会引起培养液物理性质的改变，特别是黏度、表面张力和离子浓度，从而影响气泡的大小、稳定性和氧的传递效率。发酵液黏度的改变还影响液体的湍流性以及界面或液膜阻力，从而影响溶氧速率。消除泡沫对氧的溶解有利。2）温度对菌体和发酵产物得影响A.温度对微生物的影响温度对微生物有着重要的影响，温度升高会加快生长速度，但温度过高就会促使蛋白质变性或凝固，使微生物死亡。低温只能抑制微生物的生长，其致死作用较差。各种微生物在一定的条件下都有一个最适的生长温度范围，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快。不同阶段的微生物对温度的反应不同，处于缓慢期的微生物对温度的影响十分敏感。B.温度对发酵的影响温度对发酵的影响是多方面的，对菌体生长和代谢产物形成的影响是由各种因素综合表现的结果。从酶反应动力学来看，温度越高，反应速率加大，代谢加快，产物提前生成，但酶易失活，温度越高越明显。温度还通过影响发酵液中溶解氧从而影响发酵。此外温度还能影响生物合成方向，也能影响酶系组成及酶的特性。同一种生产菌，菌体生长和积累代谢产物得最适温度也往往不同。3）pH的控制与优化（1）pH对微生物生长的影响。发酵过程中，发酵液的pH的改变，直接影响微生物细胞原生质膜的电荷发生改变，从而影响微生物的发育与生长。（2）pH对发酵的影响。每种微生物都有它最适的PH，发酵液中的pH直接影响酶的活性。发酵液中的pH影响培养基某些重要营养物质和中间代谢产物得离解，从而影响微生物对这些物质的利用。pH的改变往往引起微生物的代谢过程的改变以及代谢产物的质量和比例发生改变。（3）pH的控制与优化。在实际生产中，调剂pH的方法应根据具体情况加以选用：调节培养基的原始pH，加入缓冲剂制成缓冲能力强、pH改变不大的培养基，法发酵过程中加弱酸或弱碱进行调节pH，合理地控制发酵条件，通过调节通气量来控制pH。此外还可以利用补料的方法。通常在发酵生产过程中，pH调节方法有下列几种：（1）氨水流加法。可以作为氮源，便宜且作用快。（2）尿素流加法。4）发酵过程中补料的控制补料是在发酵过程中补充某些养料以维持菌的生理代谢活动和合成的需要。其内容可分为：（1）补充微生物能源和碳源，如在发酵中添加葡萄糖、饴糖、液化淀粉。（2）补充菌体所需要的氮源，如发酵过程中添加蛋白胨、花生饼、玉米浆等有机氮源。有些还可以添加氨水。（3）加入某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐，如磷酸盐、硫酸盐等。补料原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。1）辅酶Q10的发酵生产A.高产菌株的选育目前国内有用传统的诱变育种和高效的推理选育方法相结合的方式，以放射性根瘤菌RhizobiumradiobacterWSH2601为出发菌株，对细胞进行全面的非特异性诱变和针对合成途径的特异性诱变处理。首先定向筛选出放线菌素D抗性突变株，然后以该突变株为出发菌株，分别筛选出得到L-乙基硫氨酸抗性突变株、维生素K3抗性突变株及X-gal利用能力提高的突变株，以提高菌株积累辅酶Q10的能力。B.辅酶Q10发酵生产通过对供氧系统的最佳调节，使其生产处于最佳状态。发酵培养液中部分氨基酸浓度大小对其生成有很大影响。4.5.2.5发酵工程在食品产业中的应用为实现辅酶Q10发酵的高产目标，可以实施在不同发酵阶段采用不同方式的优化控制策略。具体策略为：在补料初始阶段采用指数流加方式，以满足细胞生长对碳源的要求，实现较高的细胞生长速率；随后分别采用恒速流加和线性递减流加的方式。2）聚γ-谷氨酸的发酵生产高产菌株的选育：通常对生产菌进行高产突变株的诱变选育。国内有学者采用He-Ne激光对γ-PGA生产菌地衣芽孢杆菌ATCC9945A进行诱变。发酵生产通常采用合成培养基，其中L-氨基酸和碳源是必需的。发酵pH呈中性，培养温度30～37℃。谷氨酸是γ-PGA合成的前体物。迄今为止，仍处于实验室阶段。3）谷胱甘肽的发酵生产（1）高产菌株的选育。物理的或化学的方法使出发菌株发生变异，再在特定的培养基中进行筛选培养得到高产菌株。（2）发酵过程的优化与控制。采用流加培养方式，加大底物浓度。在发酵过程中采用L-半胱氨酸的补加策略，以尽可能减少其对细胞生长的抑制。4)木糖的发酵生产山大的刘巍峰利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造，将木糖代谢途径引入传统的乙醇发酵菌酿酒酵母及高乙醇产生菌运动发酵单细胞中。江南大学张凌燕等以野生酵母为研究对象，利用基因工程技术构造重组菌株，增加木糖醇脱氢酶表达量。5）单细胞蛋白的发酵生产（重点）单细胞蛋白（SCP）主要是指酵母、细菌、真菌等微生物蛋白质资源。通过各种物理、化学和生物学诱变方法，或采用基因重组技术对SCP生产菌进行遗传性状的改良，从而获得优良菌株。A.适宜的菌株一般工业上生产SCP的微生物是酵母，主要有酿酒酵母、脆壁克鲁维酵母。B.优化控制发酵工艺SCP生产工艺依据原料和菌种特性的不同而已。淀粉、纤维质原料发酵前需经适当的预处理，而对于糖蜜、单糖，则只需选择一种适宜的SCP生产菌即可进行直接的纯菌种发酵。液体深层发酵和固体发酵方式。C.SCP生产工艺生产流程：①菌种选育；②菌种的活化、扩大培养及进一步扩大培养，得到大量菌株；③发酵原料的预处理、发酵培养基的配置及灭菌；④大型发酵，注意调节pH、温度、溶氧等；⑤代谢产物和细胞的分离；⑥干燥获得单细胞蛋白产品。6）乳酸链球菌肽的发酵生产A.产生菌的筛选分离具有抗菌性能的乳酸乳酸菌菌株，然后对产物进行分析确定是否为Nisin。B.发酵提取在牛乳或复合有机培养基上才能生长良好。碳源为蔗糖，磷源为KH2PO4，硫源为含硫无机盐、含硫氨基酸等，发酵温度为30℃，pH控制在5.8～6.3发酵结束后，可以用硫酸铵沉淀或硅藻土吸附沉淀进行初步分离。也可用超滤法进行分离，再利用柱层析法进行精制。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成重组遗传物质，并将其置入到宿主细胞内，利用寄主细胞而持续稳定地进行表达。4.5.3.1基因工程基础1）工具酶在基因工程中应用的酶统称为工具酶。（1）限制性内切核酸酶。有三种类型：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。Ⅰ和Ⅲ型在基因工程中价值不大。Ⅱ型酶作用时无需辅助因子或只需Mg2+,能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，同时专一性强，并且其识别序列与切割序列相一致。4.5.3基因工程（2）DNA连接酶。催化双链DNA或RNA中并列的5′-磷酸和3′-羟基之间形成磷酸二酯键的酶。即能封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。（3）DNA聚合酶Ⅰ。该酶的作用是催化聚合脱氧核苷酸，使之逐个连接到引物上去，最后形成新的DNA。（4）碱性磷酸酯酶。是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5′-磷酸残基，即脱磷酸作用。用于防止自我环化。（5）T4多聚核苷酸激酶。催化ATP上的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5′-OH上，主要作为DNA的5′端标记，标记待测的DNA片段。（6）S1核酸酶。催化降解单链DNA或单链RNA(对单链DNA的活性更高)，产生以5′-磷酸基末端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。但不能降解其双链DNA或RNA的杂合子。因此用来分析杂合子结构。（7）逆转录酶。以RNA为模板，逆转录后形成双链DNA。2)目的基因目的基因的得到有四种方法，一是采用生物学方法，二是用化学合成法，三是基因文库法，四是利用PCR扩增法。原核生物基因的分离多采用前两种，真核采用后两种。A.生物学方法原核生物中常用鸟枪击法和散弹法来克隆分离基因。优点：快速简便、产物纯度高，是天然基因。另一种生物学方法是采用分子杂交手段。根据碱基配对原理，即单链DNA分子可与它互补链相配对形成双链，从而将mRNA互补的那段变性DNA的特异序列在连续杂交系统中回收。B.化学合成法化学合成法是以单核苷酸为原料，在体外用化学方法按照已知基因的碱基序列，先合成DNA短片段，再依次连接成完整的目的基因链。C.基因文库法即DNA文库法，是指用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿体中。当需要重组体DNA某一片段时，便可以在此文库中查找。D.PCR扩增法PCR扩增法是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。包括变性、退火和延伸三个步骤。PCR扩增仪：PCR扩增仪使用方法（视频）3）基因载体在基因工程应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体。A.质粒质粒DNA的分离提取通常可采用两种方法：①选择性抽提法：用溶菌酶溶菌，根据染色体DNA与质粒DNA有相对分子质量上的差异，用高速离心法分离。②碱性SDS法。在pH12.0～12.5范围内使染色体中DNA变性，而质粒DNA不变性，乙酸中和后在高速离心得上清液。质粒DNA进一步纯化的方法：①碱性蔗糖密度梯度离心法。染色体DNA易变性而伸展为单链，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性DNA而得到分离纯化；②氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法。染色体中双螺旋开链DNA易与染料溴化乙锭结合，密度降低。超速离心后，因密度差异分离。③硝酸纤维素膜吸附法。这种材料膜吸附单链DNA。染色体DNA变性后形成单链。B.λ-噬菌体不是所有的噬菌体均可作为基因载体。自然界中的因为基因组上存在过多的限制性内切核酸酶切点，必须进行改造，保留1或2个位点。改造后的λ-DNA载体分为两类：①插入型载体。②替换型载体。C.M13噬菌体D.病毒哺乳动物细胞载体系统，如猴源细胞SV40、牛乳头瘤病毒BPV和EBV病毒载体。4）基因重组基因重组即将目的基因（或外源基因）在体外连接构建形成重组子。这种连接主要靠T4-DNA连接酶。5）转化和增殖A.宿主细胞宿主细胞是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。常用的宿主细胞以细菌为主。如大肠杆菌（应用最广）、枯草杆菌（更安全）、放线菌（主要是链霉菌）、酵母菌。B.感受态感受态是指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。C.扩增检筛转化后的菌落通常置于含有标记抗菌素的丰富培养基上进行扩增、初筛，然后再用标记的mRNA进行原位杂交、电泳等方法检测筛选出带有目的基因的转化子。然后在实际操作用这种扩增操作比较复杂。现在一般采用PCR技术扩增，这样即使很微量也能检出，并且简单方便。6）表达克隆DNA的最终目的是表达最终目的产物。基因片段增殖→转录→翻译→相应的蛋白质（或酶），甚至进而获得代谢产物。

1)利用基因工程改造和生产食品工业用酶基因工程在工业用酶方面的应用：①可以改善原有酶的各种性能；②可以将原来有害的、生长缓慢的的动植物产酶基因，克隆到别的微生物体内进行生产。目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司，生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌。丹麦诺维信公司介绍：诺维信公司是全球工业酶制剂和微生物制剂的主导企业，拥有超过40%的世界市场份额。诺维信是丹麦在华最大投资企业之一，自1994年起累计投资2亿美元，在天津经济技术开发区建立了全球酶制剂生产基地，在北京中关村科技园区设立了中国首家外资生物技术研发中心。此外，诺维信在江苏太仓建立了苏州宏达制酶有限公司；在沈阳设立了微生物生产基地；销售网络遍及全国。4.5.3.2基因工程在食品产业中的应用真菌筛选亚洲酶制剂

应用实验室生产LOGOA.食品工业用酶基因的克隆表达酶基因的克隆和表达技术的应用使克隆各种天然的蛋白质基因或酶基因称为可能。一些来自于人体的酶制剂，如治疗血栓栓塞病的尿激酶原，就可用此方法大量从人尿中提取。B.通过酶的遗传修饰改造食品工业用酶酶的遗传修饰是指将酶基因中个别核苷酸人为加以修饰或置换，改变酶分子中某个或几个氨基酸，使酶变得更有利于人类利用。基因定点突变技术的广泛应用，使酶的结构与功能关系的研究取得重大进展。例如，葡萄糖异构酶、L-阿拉伯糖异构酶等的三位晶体结构已被解析出来，并通过分子酶学的手段研究了酶的结构与功能关系。C.杂交酶定义：杂交酶是指由来自两种或两种以上的酶的不同结构片段构建成的新酶。应用：首先，利用高度同源的酶之间的杂交，将一种酶的耐热性、稳定性等催化特性“转接”给另一种酶。获得的新特性通常介于两酶之间。其次，可以创造具有新活性的杂交酶。D.开发极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种极端环境微生物目前主要研究嗜热微生物（耐高温的α-淀粉酶和DNA聚合酶已经广泛应用）、嗜冷微生物、嗜盐微生物等。美