核桃研究进展及花果园中草药花卉策划书

PAGEPAGE28PAGEPAGE28经济林木研究进展1.1核桃概述核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃属于胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)，为胡桃科落叶乔木。与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名四大干果(郗荣庭和张毅萍,1996)。核桃是重要的果材兼用树种之一，也是中国重要的出口农产品。按照FAO(2013)统计数据，2011年，我国种植核桃面积为40万公顷，带壳坚果产量为165.6万吨，占世界核桃总产量的48%，位居世界第一位。我国核桃育种工作者于20世纪60年代开始实生选种、杂交育种，80年代开始从国外引种，到目前已有超过100个品种在生产中应用。由于受环境条件限制和品种要求的影响，只有一部分品种被大面积推广，但很少有品种能占到绝对优势。特别是由于我国核桃产业的迅速发展，种植者不考虑品种的合理配置，生产中栽培品种多而混杂，许多实生繁殖的苗木时常混于其中。除此之外，由于四川品种间亲缘关系很近，有些苗木很难区分，也是造成品种混杂的原因之一。品种杂乱、种植中配置又不够合理，造成收获的坚果质量层次不齐、形状各异，加工品质不一，对果实的加工、分选都造成障碍，不仅无力参与竞争，也难以满足市场对核桃品质的需求，建立一种合适的品种鉴定的体系，合理选择生产用的品种尤为重要和迫切。坚果是核桃种植中最主要的目标产品，在栽培中合理配置品种，选用相同品种或坚果形状相近的品种对果实分选和加工有重要意义。过去的研究证实在核桃不同基因型坚果特征中(比如：坚果大小、果形、果壳厚度、核仁颜色等)存在丰富的变异(Cosmulescu&Botu,2012)。而且，坚果形状，也就是内果皮形状，是一种稳定可遗传的特性，能够在种质收集中通用(Trujilloetal.,2014)。坚果形状特征也己被国际新品种保护联盟(UPOV)作为核桃DUS测试指南中的描述符被应用。可是，仅用果实是很难区分所有品种，特别是由于许多品种的亲缘关系很近，许多坚果形状十分相近。因此，需要用一种有效并且明确的遗传指纹作为形态评价的补充来清楚的区分每一个品种。1.1.1核桃的起源核桃原产于中亚，包括中国新疆、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦和吉尔吉斯斯坦的部分区域，从尼泊尔、中国西藏、印度北部和巴基斯坦的山区往西到阿富汗、土库曼尼亚和印度，再到阿塞拜疆、亚美尼亚、格鲁吉亚和土耳其东部地区(McGranahan&Leslie,2012)，在我国的分布遍及南北。泡核桃起源于云南、四川、西藏等省(自治区)，其中地处云南大理州的漾濞县占有重要位置。20世纪80年代，有学者对泡核桃分布区考察后发现，在西藏和云南省，特别是澜沧江流域，泡核桃的种质资源也十分丰富，既有野生类型，也有栽培类型，还有半野生状态的中间类型。在西藏，目前仍存在着许多核桃和泡核桃的原始群落。1.1.2核桃的种类核桃属植物包含23个种，被分为四组，即：核桃组(SectionJuglans)、核桃楸组(SectionCardiocaryon)、黑核桃组(SectionRhysocaryon)和灰核桃组(SectionTrachycaryon)(郗荣庭,1990)，主要分布在北温带，但对亚热带、热带山地森林气候也有广泛的适应性。据联合国粮农组织年鉴资料，2011年世界上生产核桃的国家有54个(FAO,2013)。我国是核桃的原产地之一，现有核桃属植物9个种，其中原产于我国的有5个种，分别为核桃、核桃楸、野核桃、泡核桃和麻核桃；其中广泛栽培的是核桃和泡核桃，种质资源十分丰富，仅《中国核桃种质资源》一书记载的核桃品种、实生农家类型、优良无性系、优良单株和特异种质资源就有223个，泡核桃的47个(裴东和鲁新政,2011)。1.1.3核桃的分布据相关资料显示，目前核桃的分布和栽培遍及世界五大洲中40多个国家及地区，栽培总面积达到200万公顷以上(毅萍,2001)，我们国家作为核桃的原产地之一，除了黑龙江省、上海市、广东省、海南省、台湾省等省市外,全国其他省市地区均有栽培种植核桃，主要产区主要有云南、山西、陕西、河北、甘肃、河南、四川、北京、浙江、贵州、山东、新疆和辽宁省。分布于中国西南地区(四川、云南和贵州)的核桃属3个种，不仅对世界核桃属植物的起源、系统进化有着重要作用(路安民,1982)，而且对世界核桃属资源的保护和可持续利用也具有重要的作用。核桃在四川自然分布极为广泛，遍及全省各地，同时也是该省的主要经济树种之一。1.1.4核桃的价值核桃是一种营养价值、药用价值、经济价值以及文化价值都很高的珍奇果木。其中部分种的坚果具有极高的食用价值而被广泛栽培和利用，其种仁除含脂肪、蛋白质、碳水化合物外，还含钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、核黄素和尼克酸等多种成分(高焕章等,2000)。有关研究报道(郝艳宾等,2008)每100g核桃仁中含有蛋白质14.6g-19g，脂肪63g-70g，碳水化合物5.4g-10.7g，钙85mg-108mg，磷280mg-329mg，铁2.6mg-3.2mg，硫胺素0.32mg，核黄素0.11mg，尼克酸1.0mg。而且所含的脂肪中有着丰富的必需脂肪酸——亚油酸，以及对人体健康有益的脂肪酸、褪黑激素、生育酚以及抗氧化剂等化合物，具有很高的营养和药用价值，能够有效减缓和预防心脏病、糖尿病、高血压、肥胖症以及抑郁症等疾病的发生(李敏等,2009)。此外从核桃枝和皮中的提取的化学物质5-羟基-1,4-萘醌又名胡桃醌，研究表明在抗癌、抗菌作用中它起着重要功效的作用。核桃对于大多数消费者来说主要在于食用核桃仁上，不过现今的核桃市场已不单单在食用核桃仁这一项上，近年来有报道(王丰俊等,2011)一种核桃仁榨油后的残渣，即核桃粕，可以用来作为蛋白原料进行核桃督油的生产，且这种核桃酱油的品质好，这使核桃资源得以充分利用，对于核桃的综合利用未来前景大好,而且核桃酱油的开发也对健全和建立健康的中国调味品市场，有着深远的意义。核桃壳(王丰俊等,2009)也一度被作为弃物处理，然而有研究发现，用处理过的核桃壳颗粒来制造的过滤器，在石油行业中得到了良好的应用，此外核桃壳颗粒还适用于气流冲洗操作的研磨剂，并且将核桃壳颗粒添加在涂料中，能够增加涂料的鲜活立体感，如若在炸药中添加了核桃壳颗粒还能够增加威力，也可应用于化妆品行业，增加清洁效果。1.2果树种质资源鉴别技术的研究现状1.2.1我国果树种质资源的收集保存现状果树种质资源指的是具有利用价值的果树遗传物质的总体，是植物保存和改良利用的物质基础，包括栽培品种、半栽培品种、野生类型及人工创造的新类型。人们可以直接利用种质资源创造出新品种，也可以将其作为杂交亲本，进一步综合亲本有力基因来改良现有的植物品种，或做砧木材料间接加以利用，或通过诱变等方法来创造新的基因类型。大多数果树种质资源是遗传上高度杂合的多年生木本植物，背景极为复杂，许多重要的农艺性状，如产量、品质、抗逆性等，多为微效多基因控制的数量性状。中国果树资源丰富，是世界上最大的果树原产中心之一，素有“园林之母”的美称，是许多果树种类如海棠果、西府海棠、苹果、沙梨、杜梨、秋子梨、桃、核桃、泡核桃、柿、山楂、枇杷、猕猴桃、甜橙、中国李、杏、板栗、枣、酸枣、荔枝、龙眼、梅等的原产国或起源中心，是果树种质资源最为丰富的国家之一(慕茜等,2011;任国慧等,2013)。此外还有不少尚待驯化的栽培果树的近缘种、野生种和砧木资源，以及从世界各地引种的果树资源。引种的果树资源经过长期的栽培选择，形成了许多适应本地自然和栽培条件的生态类型和地方品种。中国的果树资源也为世界果树生产发展和品种改良作出了贡献。如桃、柑橘、杏、梨、甜橙等已经在世界各地栽培，温州蜜柑和中华猕猴桃也已分别在日本和新西兰广泛栽培。板栗、梨、山樱桃、毛桃、核桃楸等提供了抗病、抗寒育种的材料。我国果树种质资源工作者经过多年艰苦奋斗，在果树种质资源的评价、利用等方面作出了卓越的成就。上世纪60年代到80年代的开展了全国性果树资源普查，自1980年开始根据自然区划、树种分布，先后建立了17个国家种质资源圃，包括苹果、梨、葡萄、桃、柿、核桃、草莓、龙眼等重要果树的种质圃，以及专门保存珍贵少有果树类型的公主岭寒地果树圃和新疆名特果树圃等，截止2008年底，17个国家种质资源圃共保存种质14720份，其中郑州葡萄、桃圃保存1777份，保存份数最多；泰安核桃、板栗圃保存种质741份(王力荣,2012)，到2013年底，泰安核桃、板栗圃已保存来自全国各地以及日本、美国等国家核桃属种质资源10个种的375份种质资源(刘庆忠和陈新,2014)。随着经济的发展，又不断的选择和创造出许多果树新品种。它们不仅是果树生产和科研的物质基础，还是果树产业可持续发展的前提和保障。为了保护我国名、优、特种质及育种者的知识产权，加强和规范果树苗木市场管理，更好的利用已有资源,建立有效种质鉴别和品种鉴定评价体系十分必要。从直观的形态学观察到细胞学和分子水平的检测，许多方法被成功应用于果树种质资源的起源、演化、分类和品种鉴定中。1.2.2果树种质资源的传统鉴定方法形态学性状是植物最直观的可以进行描述的外部特征，通过比较植物学形态特征的差异来达到种质鉴定的目的。因为方法操作简单，依据所研究树种的最显著的形态特征如叶、花、果等进行区分、分类和命名，我国果树种质资源的评价主要停留在表型性状上。形态性状特别是营养器官容易受到环境变化的影响，而且由于受育种亲本的限制，许多新品种形态上愈加相似，无法用形态学方法对品种进行鉴定，也就不能进行品种纯度的检测。依据果实特征差异的品种鉴定要等到果树结果之后，周期较长，所以形态学标记已经难以满足对越来越多自然选育和人工培育的果树品种进行鉴定的要求(王国荣和吴府胜,2007)。细胞学鉴定利用染色体核型分析，实验条件相对简单，尤其是结合分带技术可以揭示出大量染色体结构的变异，但是由于染色体制片技术和分辨率的限制，核型分析在种的分类中应用较多，穆英林和郗荣庭(1988)根据核型特点，将供试的核桃属7个种分为三组，并讨论了组间及组内进化的亲缘演化关系。但将核型分析应用于品种鉴定还有一定的难度，尤其对于大多数具有小染色体和结构差异较小的果树来说，染色体核型分析还不足以达到进行品种鉴定的目的(宋婉,2000)。孢粉学鉴定主要根据植物花粉的形状、花粉的长宽比、花粉孔的大小和数量、花粉壁形状、花粉壁厚等对果树种、品种分类鉴定的方法。花粉的形态特征因为受植物基因型控制不被外界条件影响，结果比较稳定。该方法已成功用于桃(汪祖华和周建涛,1990)、板栗(谢治芳等,2006)、核桃(任列花等,2005)等果树的分类和品种鉴定中。但是实验条件和花粉制备方法不同会对鉴定的结果有影响，造成同一品种的花粉粒之间会存在个体差异，还会因为败育等影响造成花粉粒干瘪，所以以个别花粉形状的差异，作为鉴定依据，有时并不可靠，必须结合其它指标进行评定。等位酶进行果树资源鉴定曾受到广泛的关注，其研究几乎涉及所有种类的树种，取得的结果也较为理想。但等位酶活性会受时空影响，在植物的生殖、发育的不同阶段会有差异，而且在非正常生长环境或逆境的条件下，可以诱导植物合成新的特异性蛋白，导致酶谱的改变，用于果树种质资源鉴定中，显然是有缺陷的。除此之外，由于果树的生长周期较长，并且长期通过嫁接等无性方式繁殖，加上不同地域间的相互引种，造成果树中同名异物和同物异名现象十分普遍，这更为果树品种的鉴定和分类增加了难度。因此，DNA分子标记一经发现，因为反映核苷酸水平的差异，不受发育阶段、组织差异以及环境条件影响，且变异丰富等众多优势，很快的应用于果树种质研宄的方方面面。1.2.3分子标记在果树种质资源鉴定中的应用RFLP标记在品种鉴定中的应用最早，但RFLP操作相对麻烦，因此RAPD一诞生，因为简便迅速、不受种属限制、有众多的随机引物可供筛选使用，很快成为品种鉴定的常用手段。RAPD标记已成功地应用于桃、杏、李、樱桃、梅、草莓、猕猴桃、苹果、香蕉、橄榄、梨、葡萄、番木瓜、芒果、无花果等多种果树上(薛淮等,2003)。而于华平等(2009)对RAPD技术在鉴定果树品种中的科学性进行了技术上的验证与分析得出，不同果树中RAPD引物体现出谱带清晰度以及数量等方面的特点不同：碱基数为9、10与11的引物在杏、桃、李和梅上的多态性较高且谱带清晰，苹果、梨和葡萄更适合应用11个碱基的引物。在目前已有的分子标记中，SSR因其高度的多态性和可重复性高，被越来越多的用于果树旳种质资源鉴定中。Kimura等(2002)用9个SSR标记区分了6个梨属的60个基因型，Galli等(2005)用6个SSR标记区分了66个苹果品种，Cheng和Huang(2009)用7个SSR标记区分了中国32个桃品种，每个品种都有独一无二的SSR指纹，可见SSR技术在用于果树品种鉴定中的有效性。为了迅速并可靠的进行品种鉴定，Aranzana等(2001)利用AFLP和SSR两种多态性标记，对100个桃品种进行鉴定，其中9个引物组合的40个AFLP标记可区分97个基因型，7个SSR标记的32个等位基因可以鉴别78个基因型，如果将两种标记结合则可以鉴定99个基因型。由此可见，DNA分子标记无疑为果树种质鉴定提供了一种强有力的技术。除此之外，它们在遗传研究和果树生产中也有非常广泛的实际应用。UPOV已将DNA分子标记鉴定纳入农作物品种DUS测试内容，并在分子生物学技术(BMT)测试指南草案中，将构建DNA指纹数据库所使用的标记方法确定为SSR和SNP。其中，SSR标记因具有多态性高、重复性好、共显性优点，被UPOV生物化学和分子技术工作组验证为植物新品种保护最广泛应用的标记体系(张靖国等,2014)。但值得注意的是，由于不同的育种机构保存、繁殖和选育标准的差别，有些同名品种间，无论在形态上还是在DNA指纹上，都存在一定的差异，这给用DNA指纹鉴定的一致性也造成了困难(滕海涛等,2009)。近5年，研宄者综合不同标记系统，主要将形态学标记和生化标记、分子标记结合起来使用，综合的评判种质资源的多样性以及品种的分类。特别是形态学同DNA分子标记技术的结合，为种质资源提供了更为客观的评价。Malvolti等(2010)结合ISSR标记、种子形态特征(果形指数和单果重)和果实成分(总油、脂肪酸和维生素E)分析意大利十个不同地区的核桃种质，用基因分型的结果与形态学和果实生化分析的结果相互印证，认为坎帕尼亚的丘陵地区和阿布鲁佐的山区的基因型具有不同的遗传、形态和生化特征，是优异的育种的资源。Ebrahimi等(2011)用形态学指标和SSR标记分析了35个核桃基因型，认为伊朗的基因型SSR位点和形态学特征都具有很高的多样性。Trujillo等(2014)用33个SSR标记和11个内果皮特征对世界油橄榄资源库中的499份材料进行的区分，结果显示在鉴定的332个品种中验证了200个，它们有独一无二的SSR基因分型和内果皮特征。Fendri等(2010)也用SSR标记结合内果皮特征对突尼斯油橄揽资源圃的种质资源进行了区分。类似的研宄在其它果树也被开展(Ganopoulosetal.,2011)。分子标记具有众多的优越性，但它们不能预测是否不同基因型之间存在形态学或农业性状的差异。因此，分子标记只能作为形态学的重要补充，在植物新品种DUS测试中应用(Gunjacaetal.,2008)，这充分说明将不同标记系统结合来评价种质资源是顺应科学发展的新思路。1.2.4果树核心种质的鉴定与评价果树种质资源在长期自然选择和人工引种栽培过程中，形成了丰富的种质资源。随着生产技术水平的提高，人们越来越注重种质资源的收集和保存，急切的想要保护因垦荒造地、丘陵山坡开荒等，导致流失甚至濒临灭绝的资源。加之各国各地资源不断积累交换，种质资源数量也急剧增加。大量的种质资源在为果树品种选育提供丰富的遗传基础的同时，也在一定程度上给种质资源的收集、评价、研究和利用带来了困难。如何对其保存、更新和鉴定，从丰富的种质资源中快速、准确地鉴定出育种上迫切需要的优异基因，对其进行创新和有效利用。Brown(1989)提出的核心种质的概念，为种质的保存、评价和利用提供便利。它用一定的方法选择种质总保存资源中最小的资源数量和遗传重复性，最大程度地代表整个遗传资源的多样性(Brown,1989)。目前，在许多果树上已开展了核心种质构建工作，并取得了一定进展。比如在苹果(刘遵春等,2010;2012)、桃(沈志军等,2013)、核桃(王红霞等,2013)、橄榄(Belajetal.,2012)等树种中都己建立了核心种质。但其中大多数都停留在初期核心种质阶段，且多是用DNA分子标记统计分析并抽样，没有专用的果树核心种质的基地。只有少数树种运用了多种评价、鉴定方法相结合的方式进入了更高的层次的核心种质，如苹果(刘遵春等,2012)整合农艺性状和分子标记数据构建核心种质，所得的结果可能更具有利用价值。1.3核桃种质资源研究1.3.1我国核桃属植物资源多样性我国是世界上核桃属遗传多样性最为丰富的国家之一，蕴藏着众多优良基因源，如抗病、抗虫、抗逆、高产、优质等(郗荣庭和张毅萍,1992)。特别是新疆、西藏产区，核桃种质资源十分丰富，存在大量的野生种及栽培种类型，且栽培地域十分广泛。严兆福和尚新业(1987)早期对新疆核桃进行分类时发现，新疆核桃种内类型多样，包括薄壳、厚壳、早熟、晚熟、早实、晚实、麻面、小果等多样类型；种群内核壳厚薄、熟期早晚以及童期长短都包括多种类型；在早实核桃类群中，喀什、和田两地区的早实株数占该区总株数5%左右，阿克苏地区的占该区总株数15%左右，乌什县稍多。郝艳宾(2008)用53个表型数据对核桃资源的起源、植物学特征、生物学特性等性状进行描述，构建了50份核桃资源的种质资源库；根据资源实用性、代表性、多样性等原则，筛选出‘薄壳香’、‘香玲’、‘辽宁5号’和‘北京746’4份优异核桃资源。曾斌等(2013)利用SSR评价，认为新疆核桃的遗传多样性水平较高，并揭示了新疆核桃属植物的遗传变异、群体扩散及其地理系统发育进化等方面的规律，认为在进行遗传多样性保护和种质资源的保存时，应充分重视群体内不同类型个体的保存，同时也要在分布区不同区域内保存不同的群体。由于我国核桃分布地域广阔，品种类型繁多，许多特异的种质资源在逐步的研究中被发掘出来，比如分布于我国陕西省的串子核桃，耐寒、抗晚霜、青果以串状着生；红瓤核桃因其坚果核仁皮色为鲜红而得名；三棱核桃有3条缝合线；五蕾核桃青果聚集成簇状着生；乌米核桃仁皮为黑褐色；橡子核桃坚果特小、似橡子。还有一些如鸡蛋皮核桃、尖尖核桃、尖尾巴核桃、尖嘴核桃、露仁核桃、圆核桃、纸皮核桃等极为形象的描述了其坚果的特点。这些复杂的名称，形象的反映了我国核桃品种类型的多样性，以及丰富的种质资源。但是以植物特征进行的命名，造成许多种质同名异物或同物异名，这给核桃种质资源的收集、保存和评价都带来一定的困难。因此，建立简单有效的核桃种质资源的分类和鉴定方法，对核桃资源的利用和新品种选育十分必要。1.3.2核桃种质创新核桃主要育种途径有实生选种、引种和杂交育种。引种主要受品种本身适应能力，特别是生态环境条件的影响，但成本低操作简单；而杂交育种则由于核桃树树体大，不易操作，需要很大的人力、物力，而且周期长，见效慢，但杂交育种可把双亲的优良特性综合在一起，可以针对特定的性状进行育种，因此仍然是核桃品种改良的重要手段。以美国的核桃育种为例，加州大学戴维斯分校从1948年开始进行核桃育种，实生选育了‘Ashley’、‘Chico’、‘Chandler’、‘Howard’、‘Sunland’、‘Hartley’等早实、丰产品种。近年来，通过人工控制授粉，又培育了产量高、抗病性强、仁色浅、熟期早的三个品种‘Sexton’、‘Gillet’、‘Forde’，并应用杂交和回交的方式培育抗病及抗线虫品种(McGranahan&Leslie,2004)。特别有成效的是种间杂交种‘奇异核桃’的培育，它以北加州黑核桃为母本，以核桃为父本通过自然杂交获得种子后而得到的，到目前为止，在很多试验表明奇异核桃的杂种生长势强于纯种，并对核桃黑线病有明显的抗性，不但是优良的砧木类型，还是优秀的用材用品种。波兰、捷克、保加利亚等国家也主要是通过实生选种培育新品种，他们首先进行资源调査，然后从中选出优株、优系，鉴定后予以推广(郗荣庭和张毅萍,1992)。西欧国家如西班牙、法国等国主要是对美国选育出的品种进行引进、试验并进行推广，比如西班牙通过对核桃品种‘Serr’的实生后代进行筛选，选育出了抗根癌农杆菌的砧木类型(Frutosetal.,2004)。在我国，从1959年新疆早实核桃被引入北京地区后，全国许多省份开始引种新疆核桃，并在其实生后代中选育早实丰产的核桃良种。中国林业科学研究院、辽宁经济林研究所、山东省农科院果树所等单位还先后将新疆核桃与当地核桃杂交育种，培育出了‘中林1号’、‘中林5号’、‘辽宁1号’、‘香玲’、‘鲁光’等良种。林业部1989年鉴定的我国北方地区16个早实核桃新品种中，约80%与新疆核桃有渊源，其中有3个品种是新疆直接选送的，另有10个品种是其他省份从新疆核桃的实生后代中选育或利用新疆核桃为亲本或亲本之一与当地核桃杂交培育的。方文亮等(1991)在国内率先开展种间杂交，用泡核桃与新疆早实核桃进行种间杂交，获得了早实、丰产、优质和抗病的云新系列新品种5个。这些新品种的培育为推动我国核桃良种化奠定了坚实的基础。近年来，随着核桃产业的迅速发展，不同省份间的种质资源交流也更加频繁。此外，通过基因工程技术改良进行核桃遗传改良也是一条有效的途径。汤浩茹等(2001)通过根癌农杆菌C58CIATHVRifR介导法，将哈兹木霉几丁质酶ThEn-42基因导入核桃体细胞胚，获得了遗传转化的核桃植株。方宏筠和王关林(2000)以黑核桃幼胚和幼叶为外植体诱导出体细胞胚状体，并通过根癌农杆菌介导将nptⅡ和gus基因转入体细胞胚，建立了黑核桃体细胞胚基因转化体系。这些研究为我国核桃种质创新奠定了基础。1.3.3国内外分子标记运用于核桃研究的动态与比较目前，分子标记技术在我国核桃遗传多样性及品种鉴定研究中的应用，主要是运用同功酶(杨自湘等,1989)和RAPD技术对核桃种群进行地理生态型评价(吴燕民等a,2000)、遗传结构和遗传多样性评价(王正加等,2006;王滑等,2007)、种属鉴定(吴燕民等b,2000)以及寻找与核桃目标性状连锁的遗传基因(王国安等,2004)。国外分子标记在核桃上的应用主要有品种(基因型)鉴定、系谱分析、遗传多样性评价、分子标记辅助育种等方面，主要包括同功酶(Ninotetal.,2003)，RFLPs(Fjellstrometal.,1994)，RAPDs(Conneretal.,2001)，ISSRs(Potteretal.,2002)，SSRS(Foronietal.,2005)和AFLP(Maetal.,2011)等。Kafkas等(2005)利用AFLP和SAMPL(selectiveamplificationofmicrosatellitepolymorphicloci)分子标记技术对土耳其的21种核桃基因型的遗传关系进行了测定，采用8个引物，其中，6个用于AFLP，2个用于SAMPL。结果显示，230条扩增带谱呈多态性，占总数的50.4%。同时表明，与AFLP技术相比，SAMPL技术更能有效地区分遗传关系很近的核桃基因型。Dangl等(2005)根据可评性和多态性位点的数量，从147个微卫星标记中筛选出14个对47份核桃种质和1份奇异核桃(Paradox)种质进行研究，分析了每份种质相互间的遗传距离，运用UPGMA构建了遗传关系的系统树图，揭示了每份种质的家谱和起源。1.4SNP技术的原理、特点及应用SSR由于高多态性、共显性等优点可以传递更多的信息量(Madhouetal,2013)。Woeste等(2002)以黑核桃的基因组，建立了一个富含(GA/CT)微卫星重复序列的基因库，选出1500个克隆的侧翼序列设计并最终筛选出了30对多态性高的SSR引物，从此，黑核桃引物又在以后的应用中不断增加。SSR技术应用核桃属植物研宄中涉及最多的是遗传结构、遗传多样性和亲缘关系鉴定的研究。Victory等(2006)和Ross-Davis等(2008)分别对美国黑核桃和美国白核桃的遗传结构和遗传多样性进行研究，证明了此方法的可行性。1.4.1SNP的原理微卫星DNA又名简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)，是指基因组中由1~6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，其长度较短，一般在l00bp以内，广泛分布于基因组的不同位置。SSR符合孟德尔遗传规律，并且在单个微卫星位点可以做共显性分析。SSR标记利用基因组中某一特定微卫星的侧翼序列保守性较强的特点，根据微卫星的侧翼序列人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。(邹喻苹等,2001;赵春梅,2012.)。1.4.2SNP标记的特点微卫星中重复单位的数目存在高度变异，表现为微卫星数目的整倍性变异或出现重复单位中序列的变异，因而造成位点的多态性。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，从而产生了DNA片段长度多态性，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。通过对基因组的深入研究发现，不同生物体的基因组之间存在一定程度的相似性(GMCordeiro,2001)。微卫星DNA位点在属内种间，甚至在科内属间是保守的。因此，人们可以共享近缘物种SSR引物对的信息。周涵稻等(2002)用5对甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)的SSR引物(Bn92A、Bn6A2、Bn72A、Bn83/3、Bn38A)对分属不同物种的12份材料进行扩增。其中包括2个水稻品种、1个棉花品种、2个芥菜品种、1个白菜品种、2个玉米品种、2个甘蓝型油菜品种、1个柑橘品种以及1种十字花科野生植物Moricandia.nitens。PCR扩增结果显示，所有12份材料用5对SSR引物扩增出的主带片段大小一致，说明各物种基因组间存在着很大程度的相似性。因此，SSR分子标记在不同物种之间是具有一定的通用性的。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，因而成为遗传标记研究的热点。1.4.3SNP用于品种鉴定在品种鉴定中，该SSR标记也发挥了巨大的作用(Dangletal,2005)。张锐(2010)采用EST-SSR分子标记对新疆核桃种质资源遗传多样性进行评估，认为新疆核桃群体内的多态性较低，群体间的多态性水平差异较小，初步推断新疆栽培种的母本起源相同。周贝贝等(2010)还用黑核桃的引物进行了‘鲁果2号’的亲子鉴定研究，证实‘上宋6号’和‘鲁香’为其亲本，而同时用AFLP未能鉴定出亲本。Foroni等(2005)运用SSR标记探讨了意大利几个主要核桃栽培品种与当地实生种‘Sorrento’的亲缘关系。近年来，越来越多的研究者注重将不同标记系统结合起来，对研究对象进行更加综合的评价。研究者将形态学特征和SSR结合对不同品种的遗传多样性和遗传关系进行评价(Ebrahimietal.,2011;Mahmoodietal.,2013;Popetal.,2013)，结果提供了形态学特征的描述，但由于其可变性不能明确的估计出核桃的遗传关系，结合SSR标记系统，伊朗等地核桃基因型较高的遗传多样性。这些SSR引物已被证明能有效地应用于核桃基因组的扩增，然而，SSR引物在转移应用时多态性往往会降低(Dangl,2005;Karimietal.,2010)。因此，齐建勋等(2009)、Zhang等(2010)、Zhang等(2013)分别以核桃的EST文库为来源，筛选出了多态性较高的SSR引物，证明了EST-SSR的可行性和有效性，并在引物转移应用方面做了很多努力。但许多研究都证实，EST-SSR因为处在基因编码区，相对基因组SSR而言较为保守(文明富等.2011)。Wu等(2012)构建的两个BAC文库可为SSR的开发提供数据支持。通过核桃基因组BAC文库的分析，BAC末端序列(BES)总长度31.2Mb，覆盖了核桃基因组的5.1%。通过序列分析表明，BES序列中的SSR比EST中丰富，该文库是目前可利用最大的基因库。1.4.4BES-SSRSSR分子标记是在物种进化过程中形成的，在种属间重复次数不同，存在于基因组的编码区和非编码区，即来自于转录组区域的SSR，称为EST-SSR和非转录区域的SSR，也称gSSR。并且在非编码区中更加丰富，多态性也更高(Lietal.,2004)。由于具有多位点性、遗传共显性、高度变异性、基因覆盖率高、可自动化和和高通量基因分型等特点，己经成为目前植物遗传育种中应用最为广泛的分子标记(Paridaetal.,2009)。目前报道的核桃SSR引物多来源于核桃基因组编码区，通过检索核桃EST序列开发，它们在相关物种间应用具有很高旳可转移性，然而，由于EST-SSR来源于表达序列，序列较为保守，多态性比基因组DNA-SSR低，因此在鉴定高相关基因型、进行指纹图谱构建或品种鉴定中没有基因组DNA-SSR效率高(Varshneyetal.,2005)。SSR近年在核桃属植物的遗传分析中的应用，大多数仍使用的Woeste等(2002)开发的黑核桃SSR引物，核桃BAC文库的构建为非编码区SSR的开发提供丰富的资源。2研究目的与意义、技术路线20级市场营销大专（1）班：20年5月17日摘要 随着经济的发展，使人们生活水平不断提高，越来越多的人开始关注身体的健康。积极投入到健康当中，但是由于人们长期习惯了上班生活的方式，大多数不愿去健身房，也不愿意去比较远的地方。对健康的关注越突出，自然对花卉需求就越大，而平时出现在我们周围姿态万千的花卉植物主要是以观赏性为主，比如玫瑰、百合、兰花等。在姹紫嫣红的植物世界中就含有很多种药用植物。随着人类生产、科学技术、文化水平的不断进步，花卉的范围也不断扩大。可以说，凡在当地具有一定的观赏利用价值，并被人们通过一定技艺进行栽培和养护的植物，不论是孢子蕨类植物，还是种子植物中草木、灌木、乔木和藤本植物，都已包括在花卉范围之中。花卉的价值往往局限于观赏和改善环境，而忽视其药用的价值。

目前，香草盆景还是一项刚刚起动的产业，随着人们保健意识不断增强，香草盆景这个市场将会越来越大，开家香草盆景店，前景十分广阔，效益也可观。

香草盆景可分为三类：第一类闻香类：中华香草、香水草、香兰草等；第二类闻香理气类：七里香、薰衣草、西洋甘菊等；第三类杀菌驱虫类：蚊净香草、香蜂花、藿香等。《花果园中草药花卉》创业计划前提随着人们生活水平的不段提高，对健康的关注越突出，而平时出现在我们周围姿态万千的花卉植物主要是以观赏性为主，比如玫瑰、百合、兰花等。在姹紫嫣红的植物世界中就含有很多种药用植物。随着人们生活水平的不断提高，人们在生活中都喜欢闻到芳香的气息。目前，香草盆景还是一项刚刚起动的产业，随着人们保健意识不断增强，香草盆景这个市场将会越来越大，开家香草盆景店，前景十分广阔，效益也可观。花店概述`2.1宗旨我们立志在于使人们在享受花草美妙姿态的同时得以改善身体。在大家接受芳香花草的过程中发展芳香花草的市场，使芳香花草得到广泛的推广甚至普及。大家以健康的笑容迎接每一个明天是我们的目的！芳香花草被广泛接受、发扬创新是我们的奋斗目标！◆传承依旧我们会以各个成功的花卉公司经营理念为指导，使植物的婀娜姿态表现的淋漓尽致，给人们带去充分的感官享受，不失其作为观赏植物的性能。◆把握个性香草盆景可分为三类：第一类闻香类：中华香草、香水草、香兰草等；第二类闻香理气类：七里香、薰衣草、西洋甘菊等；第三类杀菌驱虫类：蚊净香草、香蜂花、藿香等。◆挖掘潜质芳香花草的鲜用功效是不容小觑的。我们可以指导客户根据自身情况于家中种植无毒或小毒的可鲜用药材养生保健，除菌驱蚊。我们公司的中药研究部门也可接待客户关于养生保健方面的问题，更好保持公司和客户的互动关系以便以后业务的进行。2.2花店的结构花店所有权和经营权相分离，实行店长负责制。下设执行执行部下、有服务人、管理人员、财务人。主要合伙人：吴洪、向婷婷和刘娅等三人构成。2.3花店的经营策略○鼓励创新与学习，保持高度企业活力创新是我们生存的命脉，一旦停止创新，将很快面临没落与失败。我们不但要在花卉植物的姿态及药用价值上追求创新，在企划、营销，管理等各方面更要强调。○专注于中草药观赏与药用的本业我们的本业是「中草药观赏与药用」，这个领域势必将蓬勃发展，只要我们集中团队力量，积极从事，发展空间必定无可限量。因此，我们要心无旁骛、全力以赴，在本业中谋求最大的成就。○饮水思源，重视员工福利与股东权益，回馈社会我们要提供员工一个能全心付出的福利待遇，同时让股东对花店的投资得到满意的回报。同时，花店的成长既然得力于社会及产业环境的配合，我们更要不断地尽能力回馈社会，做一个良好的社会公民。产品特色根据贵州的地理位置及中药的发展同时依附于贵州十里不同天的气候环境，芳香花草在贵州省境内广泛分布，原料丰富，野生品种众多，挖掘潜力大。从根本上保证我们花店芳香花草的品质以及原生态特色设计的竞争优势，迎合了贵州林城特色！让贵州的山更绿，水更清。产品介绍3.1、大规格绿化苗木和多季开花的灌木，尤其是适应性强的乡土树种。这方面我省有非常明显的优势，我省有许多资源，包括人工栽培的和山上野生的资源。但要将这些优势转化为现实，还有很多事要做。要求我们花卉店与生产商通力协作，同时还有得到各级政府的大力支持与帮助。3.2、新兴的花卉品类，包括组合盆栽、水培花卉、易拉罐花卉等。组合盆栽，虽然在国内市场上已出现数年，但由于许多生产环节不配套，消费市场还没有培育成熟，直到近一两年才在各大中城市开始流行，并展现出良好的市场潜力。水培花卉易拉罐花卉是以经过特殊配方的无菌培养介质及花卉生长所需的缓释肥料代替传统的泥土，并将其按照比例装人易拉罐，植入花种后进行真空密封。买回家后，揭开盖子和排水孔，加水后7天左右就可发芽。易拉罐花卉见市已有一段时间，但由于许多产品质量不过关，市场上劣质产品盛行，生产与销售单位缺乏诚信经营的观念，严重打击了消费的积极性而一直没有大的作为。但真正质优价廉的产品却始终畅销不衰，市场潜力十分巨大。3.3、闻香理气类：中华香草、香水草、香兰草甘菊、贡菊、杜鹃、金莲花、金银花、辛夷花、紫罗兰、芙蓉花等，这些鲜花不仅能使空气变得清新，其释放出的香味具有很多化学成分在改善人脑的疲乏状态，释放压力等有着很好的作用，市场前景广阔。

3.4、香化植物。又称芳香植物、保健花卉等。主要用于新装修的房屋和办公室，用于吸收室内有害气体及缓解有害射线辐射，是一种新兴的保健花卉。市场分析4.1市场概况花卉业一直是世界最具活力的产业。它有突出的社会效益、环境效益及经济效益。花卉，不仅美化环境，而且古往今来一直是人类情感表达的载体，所以其市场是永恒的。花卉产品已成为国际贸易的大宗商品。花卉的世界产销格局基本形成。在贵州省范围内有巨大的发展潜力，鲜花和中草药结合具有很大的市场吸引力。近10年来，在世界经济形势普遍不景气的背景下，花卉业却始终以两位数的速度增长，成为目前世界农业最具活力的产业之一，而随着世界各国经济的复苏，世界各主要花卉出口国对花卉业持续大幅增长都持有乐观的态度，许多国家都把它作为出口创汇重点产业来培植。目前，我国的花卉出口额只占国际市场的0.5％，但因为我国花卉业具有气候、劳动力资源等多种优势，如果国内企业提高劳动生产率，树立自己的品牌，那么在出口方面一定能有较大的突破。而不断变化的市场则要求生产者要不断调整品种结构，才能培育出区域型的优势特色品种，并在竞争激烈的市场上占有一席之地，进而做大做强。4.2目标市场我们将我们的目标市场定位于各个新户、门面、中小型企业及个人。我们特地设置出来代表店，于客户亲密接触第一手的掌握我们需要的情报。4.3SWOT分析优势（S）随着人类生产、科学技术、文化水平的不断进步，花卉的范围也不断扩大。可以说，凡在当地具有一定的观赏利用价值，并被人们通过一定技艺进行栽培和养护的植物，不论是孢子蕨类植物，还是种子植物中草木、灌木、乔木和藤本植物，都已包括在花卉范围之中。花卉的价值往往局限于观赏和改善环境，而忽视其药用的价值。在我国传统中医药中，以花为药用部位的药用植物广为应用。在开业之前，我们做过市场调查，对花果园附近同行业有了初步的了解，我们开业结合自身的优点和市场上对床上用品的需求，有针对性的寻找适合消费者的产品，我们还会组织一个优秀的策划小组，为我们出谋划策。劣势（W）和其花店相比，我们店不具有经验优势，且进入市场时间晚，在市场方面没有先入为主的优势。在货品数量和货期上没有一个很好的估计，致使花卉没能很好的符合市场的需要，周转资金较为短缺。机会（O）随着生活水平的提高，芳香花卉市场正处在市场变革前期，加上人们对生活质量要求的提高，“享受”式的消费能力不容忽视。我国花卉正在逐步由“数量消费阶段”转向“质量消费阶段”。且现在，消费者在购买花卉时候更加注重款式和效用。威胁（T）一是来自同行竞争的冲击。同行竞争者相对于我们来说经验很丰富，进货渠道相对稳定，对于消费者的需求有一定的实际了解，而我们只是停留在理论阶段。二是来花卉市场批发零售商的压力。他们不但批发普通花卉，同时还零售，价格比一般店铺可能还便宜随着人类生产、科学技术、文化水平的不断进步，花卉的范围也不断扩大。可以说，凡在当地具有一定的观赏利用价值，并被人们通过一定技艺进行栽培和养护的植物，不论是孢子蕨类植物，还是种子植物中草木、灌木、乔木和藤本植物，都已包括在花卉范围之中。4.4市场定位我们店面主要选在花果园十字路口处，这样就从根本上店面视觉效应这个难题，我们已芳香花草栽花卉为主，同时推出易拉花卉和茶用和药用花，已中高端花卉为主。5.营销策略及销售5.1合作伙伴贵州高等商业专科学校贸经系、市场营销专业，园艺学院、林学院。合伙人；吴洪，男22岁市场营销专业负责全面工作及宏观政策。9刘娅，女20岁市场营销专业负责财务和进货的渠道。向婷婷，女20岁市场营销专业负责销售工作及店面日常管理。5.2市场沟通采用重点轰炸式结合点拨提醒式的媒介投放策略。媒体选择第一顺位媒体——省级电视台平面广告第二顺位媒体——主攻城市的晚报、广播·构建自己的网站，提供充足的服务信息·参加相关的大型会展，发表公司的科技人文成果充分发挥媒体的组合原则，使软性和硬性广告宣传与整体策划、促销公关活动结合，以组合方式达到市场份额和销售目标的实现。5．3价格方案在营业之初，采用的定价方法是盈亏平衡法，然后会采取反向定价法来获取一定的利润，先根据市场调查看消费者能接受什么样的价格再反向确定自己的成本价，在自己的成本上严格控制，使成本最低化。6.财务规划各种认证、许可、商标5000元；公司组建、租地、人员雇佣30000元；店面租金、水电费20000元；广告宣传5000元；周转资金50000元；生产成本20000元 每人出资约为23000元共计：130000元（1）固定资产名称数量单价备注电脑13600办公用电瓶车12000-长安之星120000-货架35