工业微生物育种资料

第一章：绪论一、发酵工程1、概念：利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，生产有用物质一种技术系统。一般是在发酵罐中生产，是生物加工和生物制造实现产业化的核心技术。2、突出特点：①以可再生资源为原材料；②反响条件温和〔相比化学合成〕多为常温常压，反响能耗低、选择性好、效率高的生产过程；③环境污染少，不产生重金属、有害化学物质；④投资较小(与反响条件直接相关〕⑤能生产目前化学生产不能生产或者生产困难的性能优异的产品。所以发酵工程已成为工业领域重点开展的行业。Eg:Aas,vit与有机酸、抗生素等。3、中国发酵工程的现状：有一定的根底，但参差不齐与国外差距大，就产量而言，主要是糖化酶，高温α-ainylase,碱性蛋白酶，以糖化酶为例，自1988年引进高产的菌株后，发酵水平一直鲜有提高，酶活性仍停留在3500u/ml左右。而国外已到达50000u/ml以上。由于剂型单一及质量不稳定，中国酶制剂产品很难进入国际市场，也挡不住国际市场产品进入国内市场，总的来说，中国生产的发酵产品的产业化程度很低，科研成果转化为生产力的周期长，速度慢，技术水平和装备水平还有待进一步提高等。所以与国外的差距大，生产本钱明显高于国外。4、发酵工程队促进国民经济开展的重要作用。⑴农业：如陈化粮的问题;；⑵能源：如石油的问题；⑶化学工业：医药工业〔中国两大支柱产业〕方面的提高等等。这些方面都能有效地提高民族工业的国际竞争力，实现国民经济的持续开展。5、发酵工程技术的内容。⑴提供高性能生产菌种的菌种技术；⑵实现低本钱，大规模生产产品的发酵技术；⑶获得合格产品的别离提取技术。二、工业微生物育种在发酵工业中的地位。工业微生物：应用于发酵工业的微生物，是指通过工业规模培养能够特定产品或者到达特定社会目标的微生物。菌种技术的内容：⑴菌种筛选技术；⑵菌种选育技术；⑶菌种保藏技术。筛选是指从自然界中获得具有生产目的产物的菌株；选育是指提高菌株生产性能；保藏那么是指保证菌种生产能力能长时间维持。这些都是育种学的内容。Bac育种的必要性：菌种是发酵的根底，是生产的役马。既是发酵过程成败的关键，更是表达经济效益和工作效益的关键，一个好的工业菌种可以形成和开展出一个工业形成一个产业；同样，现代工业生物技术的开展，也不断要求有新的性能更优越的工业菌种的出现。⑴人类社会可持续开展的需要。大自然中Bac资源及其丰富，据估计，地球上Bac的种类有106到107种，而被人类了解的仅占10%全世界被描述的Bac种类仅占实际的2%，目前被人类利用的Bac仅占总量的1%，人类为了自身的生存与开展，必须从自然界中索取各种资源加以利用。现在，人口急剧膨胀，工业化速度加快，自然资源特别是矿物质能源过度，过快地被消耗，环境污染日趋严重等问题，迫使人们加速开发Bac资源。利用Bac增产粮食，提供新的蛋白质资源、生产工业乙醇及氢气等洁净能源。加速环境治理，比方利用Bac初级代谢和次级代谢产物，如抗生素、Aas、酶、有机酸等。⑵发酵工业开展的需要。例如：青霉素发酵水平的提高，弗莱明在20世纪20年代发现青霉素时，所产青霉素的菌种为青霉菌，发酵单位为2u/ml,1943年，美国最早使用黄青霉，所产青霉素的单位为250u/ml。后来Demerce用X射线诱变黄青霉菌株，得到青霉素单位为500u/ml。20世纪80年代，青霉素效价为85000u/ml。⑶是中国发酵工业的现实需要。国内菌株的发酵水平与国外相比总的来说还比拟落后，发酵产品的品种也较少，如酶制剂。丹麦的诺维公司生产有α-amylase糖化酶、蛋白酶、果胶酶、核酸酶、纤维素酶等品种，尽各种规格即达100多种，国内生产的一直是三大当家酶种，即糖化酶、α-amylase和蛋白酶。此外，再加上近年来陆续开发的少量品种如纤维素酶、凝乳酶、异构酶等，品种数量到达30多种。但淀粉酶的产量占酶制剂总量的75%，其他酶类那么更是，品种也不全，产品结构不合理，远不能满足各行各业的需要。菌种选育的意义。⑴决定发酵产品能否具有工业的价值；⑵是发酵成败与否的关键；⑶是提高发酵工业产品的产量和质量增加了产品的品种的关键。工业Bac菌种的生产要求。稳：⑴遗传稳定，有利于产品优良性状的传递；⑵性能稳定，能保持较长的良好经济性能，菌种的优良性能不易退化；⑶目的产物的产量稳定，不随生产批次的改变而改变；⑷繁殖快，易产生营养细胞、孢子或其他繁殖体；⑸菌种生长快，种子的生长必须旺盛，在短时间内就能到达产品最正确生产期；⑹目的产物产生的时间快，产生目的产品的时间短，即发酵时间短，提高生产效益；纯：⑺菌种纯。是纯种，防止产品含有杂质，防止发生倒灌；易：⑻菌种易别离提纯〔以获得纯种，而且一旦感染上杂菌，能容易别离纯化〕；⑼易于突变，对诱变剂敏感，有利于菌种加强；强：⑽抵抗能力强，有自身保护机制，能抵抗杂菌污染。即稳、快、纯、易、强。只有具备了这些条件的菌株，才能保证发酵产品的产量和质量。这既是发酵工业的最低要求，也是发酵工业的最大目的。三、遗传学的形成和开展。遗传学时生命科学领域中一门核心学科。主要研究内容：①遗传物质的结构；②遗传信息的传递；③遗传信息的功能；④遗传信息的表达。分类：①传递遗传学，级经典遗传学。主要研究遗传物质纵向传递的规律及基因型与表型的关系；②分子遗传学。主要研究基因结构，功能和纵向传递〔结构是指其化学本质与精细结构，功能指他的表达、调控、重组和变异〕；③群体遗传学，研究群体中基因频率和基因型频率以及影响其平衡的各种因素。特点：①推理性强，是一门推理性的学科。遗传学的研究方法是根据自然现象和实验数据推理出一种假设，然后通过实验加以验证；②多学科交叉与融合。遗传学主要建立在生物化学、细胞生物学和统计学的根底上，但又涉及生命科学的各个领域；③开展快。遗传学的开展非常快，新理论、新技术、新成果层出不穷；④应用性强。转化为生产力的周期短，以其为理论根底，已派生出许多应用学和植物等微生物育种学、优生学、生物工程等。遗传学的开展。遗传学的开展大致可分为三个时期：⑴细胞遗传学时期〔1910-1940〕。此时期主要是确立了遗传学的染色体说。摩尔根提粗了连锁交换定律，并确定基因直线排列在染色体上，形成经典遗传学的理论体系；⑵微生物遗传学和生化遗传学时期〔1941-1969〕。这一时期的特点是遗传学研究的对象从真核生物转向原核生物，并更深入地研究基因的精细结构和生化功能；⑶分子遗传学时期〔1953双螺旋结构模型的建立到现在〕四、工业微生物育种的进展。〔一〕工业微生物育种的根底：遗传与变异。所谓遗传是指亲代和子代相似的现象，而变异是指亲代与子代之间或同一亲代产生的不同子代之间存在的某种差异，变异提供遗传的材料，遗传那么保证优良性状的积累。〔二〕工业微生物育种技术的开展阶段。1、自然选育：自然选育是不经人工处理而利用微生物的自发突变进行的纯种别离方法。单菌落别离，是一种简单易行的育种方法。例如：酒精发酵，利用自然选育纯种是酒精生产稳定〔包括性能、产量、生产时间等方面的稳定〕但是突变频率高与低，存在很大局限性。2、诱变育种〔上世纪90年代〕以人工诱发基因突变为根底的育种技术。例如：抗生素的生产，特别是青霉素生产。诱变育种到目前为止还是很重要的育种方法，尤其是发酵工业中优良高产菌株的选育。3、杂交育种〔20世纪40年代〕微生物的杂交育种不是简单的物种之间优良性状的组合而是建立在诱变育种的根底上，而且克服生物物种之间相似性的影响〔即亲和性〕。杂交不仅发生在种内，也可以成功地发生在种间和属间。杂交主要是消除诱变剂的“疲劳效应〞等副反响，集不同菌株的优良性状于一体。4、推理育种。〔20世纪50年代〕又称代谢控制育种。是根据微生物代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制，通过人工诱发突变的技术，筛选获得改变微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地是目标代谢产物选择性地大量合成和积累的技术，以谷氨酸发酵为标志，意味着诱变由盲目性走向理性。5、代谢工程育种〔即传统意义的基因工程育种〕利用基因重组技术对细胞代谢网络进行有目的的定向修饰，先对细胞的分解和合成代谢中的多步级联反响进行合理设计，然后利用DNA重组技术强化或灭活控制代谢途径的相关基因。6、基因组重排育种〔基因组改组〕是2002年新报道的对微生物整个基因进行重排的育种方法。采用的具体方法是先用诱发突变或点突变技术产生复杂子代组合库，然后采用循环原生质体融合，使其产生同源重组，产生各种各样的突变组合。第二章．微生物细胞的结构与分裂第一节微生物细胞结构与功能细胞是生命活动的根本单位，一切有机体〔除病毒外〕都是由细胞构成。细胞是构成有机体的根本单位；细胞具有独立有序的自控代谢体系，是代谢与功能的根本单位；细胞是遗传的根本单位，具有遗传的全能性。细胞是多层及非线性的复杂结构体系，是物质与信息、能量过程精巧结合的综合体，是高度有序的，具有自组装和自组织能力的体系。微生物的分类：微生物通常是指那些单细胞的或由相同组织构成的多细胞有机体。分为五类：1、病毒。真病毒、类病毒。2、真细菌〔具有原核细胞结构〕古细菌3、真菌4、藻类。5、原生动物体。按细胞结构及遗传信息分为真核微生物和原核微生物。细胞壁的结构与功能。功能：①对细胞起保护作用；②维持细胞行动；③对物质的交换起局部调节作用〔有些分子能进入有些那么不能〕；④决定细菌的抗原性、致病性急对病毒的敏感性。1、主要成分。⑴肽聚糖。细胞壁的有效成分。但G-含量低。①双糖单位N-acety/glucosamine(G)N-acety/muramicacid(M)G、M以β-1、4糖苷键连在一起，该键是溶菌酶的作用位点。②短肽。由4个Aas〔有时是5个〕残基组成，且D型和L型交错出现，一般连在M上。③肽桥。连接前前后后两个肽聚糖的一小段Aas.NH2前一短肽中的第4个Aa相连，而-COOH与后一肽聚糖单位的短肽中的第三个Aa相连〔青霉素抑制转肽酶的活力，使短肽和肽桥不能形成〕；⑵磷酸壁。G+特有，分两种类型，即壁磷壁酸和膜磷壁酸，青霉素可阻碍壁磷壁酸中甘油磷酸链与肽聚糖分子间进行共价结合。膜磷壁酸甘油磷酸链与细胞膜的磷脂共价结合。⑶脂多糖〔LPS〕为G-所特有，有类脂A，核心多糖和O-特异性侧链三局部组成。LPS是细菌的内毒素，其物质根底是类脂A，O-特异性侧链决定抗原特异性〔由3-5个单糖组成的重复单位聚合而成〕。⑷PW，G-含量多一些，G+那么少一些。2、G+与G-细胞壁成分及结构的差异。肽聚糖含量高〔G+〕低〔G-〕肽聚糖层层数多交联度高、厚层次少、交联度低、薄磷壁？有无Pw低〔约10%〕高〔约60%〕类脂无或少量高〔2%-3%〕诱菌酶分解作用敏感不敏感对？霉素作用3、缺壁细胞〔1〕原生质体与原生质球原生质体----------一般由G+形成原生质球----------一般由G-形成，还残留局部细胞壁〔2〕L-formofbacteria通过自发突变而形成的遗传稳定的细胞壁残缺型(3)支原体无细胞壁的G-小型原核生物。是生物界目前能独立营养的最小型生物。〔二〕酵母菌cell壁三明治结构〔Hanno甘露糖〕由葡聚糖、甘露聚糖蛋白质和几丁质组成。可由蜗牛消化酶水解。〔三〕霉菌cell壁主要由纤维素、几丁质、葡聚糖、少量蛋白质组成--蜗牛消化酶水解〔四〕藻类cell壁主要由纤维素、木聚糖、甘露聚糖、杂多糖、脂类构成二：细胞壁以内的构造〔一〕流动镶嵌型1、特征：具有极性头部和非极性尾部的磷脂双分子层是生物膜的根本结构成分Pro.vs不同形式镶嵌在脂双分子层的结合在其外表。Pro的类型.分布的不对称性及其与脂分子的些作用是物膜特征和成效的根底。生物膜可以看成是pro在脂分子中的二维溶液2、成分〔1〕膜脂①成分：a.磷脂b.糖脂c.胆固醇和中性脂肪〔细菌中不念胆固醇，但含有甘油酯特性脂分子〕②膜脂的运动方式，有4种沿膜平面的侧向运动b.膜分子绕轴心的自转运动c.脂分子尾部的摆动d.双层脂分子之间的翻转运动〔2〕膜蛋白①．膜周边蛋白or外在蛋白为水活性蛋白。靠离子键or其他较弱的键与膜外表的pro.or脂分子结合。改变溶液的Ior提高T。就能从膜上别离下来。膜的结构并不被破坏膜内在蛋白or整合蛋白与膜结合相当紧密，只有用去污剂才能别离出来。3、膜的流动性〔1〕.膜脂的流动主要指膜分子的侧向运动。〔2〕.膜蛋白的流动成斑现象和成？？现象膜蛋白在脂双层中的运动史自发的热运动。不需cell代谢产物的参与，也不需提供能量。4、膜的不对称性膜脂的不对称性：即同一膜脂分子在脂双层中不均匀分布膜蛋白的不对称性：指酶种膜蛋白分子在cell膜上都有明确的方向性，如cell外表的受体。膜上载体蛋白都是按特定的方向传递信号与物质。膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂，有序的各种生理功能的保证5、Cell膜的功能为cell的生命活动提供相对稳定的内环境选择性的物质运输，包括代谢第五的输入与产物的输出，其中伴随E传递为多种En〔酶〕提供结合位点，是En促反响高效有序地进行。提供En结合位点，是酶促反响高效有序地进行。参与形成不同功能的cell外表特征结构〔如间体，鞭毛〕？？体又称中体，多见于G+，主要促进cell间隔的形成，并与遗传物质的复制及其相互别离有关，是cell外表特征性的一个结构。〔二〕细胞质1.空核Bac的细胞质和内含物〔1〕特点：不流动，中间含有内含物，包括各种贮藏体、羧酶体、气泡体等〔2〕贮藏体：由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒。功能：贮藏营养与能量；种类有能沉及能量类、氮源类、磷沉类等2.真核Bac的细胞质与细胞器〔1〕线粒体：氧化磷酸化、合成ATP、提供E〔2〕溶酶体：作用于pro糖、脂、核酸等，使其水解，进行Cell内清等，维持Cell营养，防止Bacor异物体侵袭〔3〕微体：①过氧化物酶体、单膜、使cell免受H2O2等过氧化物的毒害。②乙醛酸循环体，使cell内的脂肪通过乙酰CoA和乙醛酸循环合成糖类or其他cell成分〔4〕内质网分粗面内质网〔VER〕和滑面内质网〔SER〕VER含核糖体，合成分泌性pro和多种膜蛋白SER不含核糖体，合成脂质功能：pro合成、脂质合成、pro修饰与加工--二硫键的形成糖醛化、酰醛化羧醛化？？？？的折叠与装配〔5〕高醛体①参与Cell分泌活力，对各种pro自身携带的？？信号识别进而对其进行分类、包装、？？②pro的糖醛化及其修饰③pro的水解及其他加工过程〔如将前体加工成有活性的物质〕〔6〕液泡贮藏营养物质及水解酶类、调节渗透压3.核糖体合成pro、真核80S〔60S、40S〕、质核70S〔50S、30S〕〔三〕细胞核与质粒1.原核生物的核质体质核Bac没有膜包围，但与细胞质有一定的联系，一般附于间体上2.真核Bac的细胞核〔1〕核膜有核小孔、供物质选择性运输，非均匀分布〔2〕核仁合成rRNA，装配核糖体亚单位〔3〕核基质〔4〕染色质分裂间期遗传物质的存在形式3.质粒独立于染色体外的基因组质粒的根本特性a.独立自主地复制〔松弛型、严密型〕b.不相密性〔一般情况下同一cell种只存在一类质粒〕c.转移性d.非必需性〔对宿主细胞而言是非必需的〕在后面的基因工程中主要讲集中具体的类型，此处略。〔四〕芽孢与伴孢晶体三、cellwall以外的构造〔一〕荚膜组成：水〔>70%〕、多糖、多肽、pro功能：a.保护作用、防枯燥、防吞噬、防噬菌体b.贮藏养料c.堆积代谢废物d.外表附着〔二〕鞭毛1.细菌的鞭毛、菌毛、性菌毛鞭毛：运动、年老的易失去菌毛：吸附功能性菌毛：供体菌DNA转移到受体菌2.真核生物的鞭毛与纤毛：是真核生物cell骨架的成分之一，功能是运动cell分裂真核Bac细胞有核仁，进行有丝分裂和减数分裂，细胞分裂与DNA复制严格同步Pro细胞无核仁，进行无丝分裂和减数分裂，细胞分裂与DNA复制并不同步1.细菌的繁殖(1)二分裂，细菌最普遍，最重要的繁殖方式a.在原间体上形成以新间体〔DNA附在间体上〕b.一股DNA断裂并以其一端附在新的间体上c.两股DNA分别复制成两分子DNA，与此同时，cell物质增加，cell膜延长，两DNA别离d.细胞中央局部两个间体之间形成隔膜e.得到两分子cell〔2〕不等二分裂，如柄细菌，单一端单毛菌带鞭毛的细菌→鞭毛端长出一个柄，鞭毛消失→细菌伸长，在柄的相对端长出一根鞭毛→二分裂形成一带柄cell和一个在柄的相对端极生一根鞭毛的细菌→有鞭毛的细菌游走〔3〕出芽生殖；(4)二分裂；〔5〕多分裂G-的蛭弧菌以多分裂存在于宿主中形成多个子cell2、放线菌的繁殖：大多数以分生孢子繁殖，有些以菌丝断裂的方式繁殖真核生物有丝分裂，有性生殖，减数分裂〔略〕遗传的物质根底遗传物质根底确实定〔遗传物质的根底是核酸〕肺炎链球菌转化实验噬菌体的感染实验烟草花叶病毒拆分和重建实验〔RNA〕染色体真核生物与原核生物的遗传物质的主要区别真核生物的遗传物质是DNA，而原核生物的那么为DNAorRNA真核生物的染色体由DNA和组蛋白组成，而原核生物的那么由纯DNAorRNA组成真核生物的染色体不止一个，而原核生物往往只要一个真核生物的染色体为核膜包被，而原核生物那么没二、DNA在真核生物中的存在状态〔一〕染色体1、分类根据着丝粒的位置分为四类：中着丝粒染色体；近着丝粒染色体；端着丝粒染色体；远着丝粒染色体。2、结构〔1〕着丝粒：两个染色单体相连的部位，在染色体上的位置固定形成主缢痕〔2〕次缢痕：除主缢痕外，染色体上其他的浅染色缢痕部位，它的数目位置和大小是某些所特有的特征〔3〕核仁组织区(NOR)：位于染色体的次缢痕部位，但并非所有的次缢痕部都有NOR〔4〕端粒：染色体两个单部特化结构〔5〕随体：位于染色体末端的球星染色体的末端，有随体的称为sat染色体〔二〕染色体外的DNA真核生物染色体外的DNA主要以细胞器的形式存在。一般都和其他物质在一起。细胞器包括：线粒体、叶绿体、中心体、毛基体、质粒、纺锤体等。这些细胞器存在一些共性成分复杂〔DNA、RNA、糖、脂、RNA等〕结构复杂〔叶绿体和线粒体具有复杂的膜结构，中心粒和毛基体具有微管结构〕功能不一，且与细胞生命活动不可分，作用大数目多少不一自主复制一旦消失，后代cell中不再出现〔三〕真核生物染色体结构1、染色体的根本结构单位—核小体〔1〕每个核小体单位包含200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体。H2A、H2B、H3、H4各两个〕及一个分子的组蛋白H1。〔2〕组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构〔由四个二聚体、两个H3A、H4形成四聚体，位于核心颗粒中心，两个H2A、H2B二聚体位于四聚体两侧〕〔3〕146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白1、75圈，组蛋白H1在核心颗粒外的20bpDNA，锁住核小体DNA的进口和出口，在稳定核小体的作用下，H1和166bp的核小体结构又称染色质小体〔4〕两个相邻核小体之间以DNA相连，长度o-80bp不等，典型长度60bp〔5〕组蛋白和DNA之间的相互作用主要是结构性的，本不依赖于核苷酸的特异序列，即具有自主装配的性质〔6〕核小体沿DNA的定位受不同因素的影响2、染色体包装的结构模型〔1〕染色体包装的多级结构模型DNA压缩7倍核小体6倍螺线管40倍超螺线管5倍染色单体〔2〕染色体包装的放射环状结构模型DNA——核小体——螺线管——DNA复制环——微带——染色单体每18个复制环呈放射状排列，结合核基质形成微带二、DNA在原核生物中存在的状态原核生物的染色体DNA的量远小于真核生物，原核生物中，细菌和放线菌的遗传物质为双链DNA，在病毒中那么有DNAorRNA，是dsorss,呈放射状or线状。大肠杆菌染色体dsDNA+pro〔Hu和H2vs〕——超螺旋——功能域环——脚手架染色体外DNA：质粒三、染色体数目真核生物多为二倍体，原核生物多为单倍体整倍体：个体中的染色体数为常数的整数倍。如二倍体，三倍体，单倍体非整倍体：指个体中的染色体数为常数的非整倍数。Eg：缺对性个体：缺少一对或几对染色体单体性个体：缺少一对或几对的一条的染色单体二体性个体：加倍体三体性个体：一对或几对染色体增加一条染色单体第二节核酸核酸种类A、T、G、C、U——磷酸核酸——核苷酸————戊糖——核苷————碱基按规定，DNAorRNA的序列5’写在右边，故DNAorRNA链有极性二、RNAormRNA有二级结构。tRNA的二级结构为三叶草，三级结构为L-型，rRNA有二级结构三、DNA1、modeldoublebelix2、DNA构型3种〔1〕B-DNA即Watson-crickModel,右手螺旋，正常生理状态时，DNA为B-DNA，DNA分子每绕一圈为10.4个bp〔2〕A-DNA右手螺旋，高盐or脱水状态时，DNA的构型活体中DNA与RNAorRNA配对时为此种形式，DNA每绕一圈11个bp〔3〕Z-DNA左手螺旋，双链中碱基平面与螺旋中轴不再成直角，Z-DNA每绕一圈为12bp，该构型多集中于调控区与基因表达的调控有关3、DNA复制〔1〕互补复制〔2〕酶促反响〔dNTP、聚合酶、Mg2+〕〔3〕链的伸长〔前导链、滞后链〕〔4〕DNA复制的起点与复制子：独立复制的单位为复制子，高等生物为多复制子，原核生物为单复制子〔5〕合成时需要合成RNA引物，这是由于DNA 复制的DNA聚合酶不能开始新的DNA的合成，只能在RNA后面先参加一个碱基脱氧核苷酸第三节基因的组织与结构基因组概念：对原核生物来讲是它的整个染色体，对多倍体生物而言是指能维持配子or配子体正常功能的最低数目的一套染色体DNA序列分类重复序列是基因结构的一个特点，根据重复序列可将DNA分为四类单一序列：在一个基因组中只有一个copy轻度重复序列：在一个基因组中有1-——20个copy中度重复序列：在一个基因组中有10——12万个copy，对基因起调节作用，一般不编码高度重复序列：在一个基因组中有几百个——几百万个copy，有一些是rRNA和某些tRNA基因，大多为不编码序列二、基因1909年，丹麦遗传学家W.LJohonsson首先使用“gene〞这个词，用来表达孟德尔的遗传因子，后来又有顺贩子，操纵子等说法。概念：一个具有遗传因子效应的片段，是遗传物质的最小功能单位，根据目前的认识，基因应该是能够表达和产生基因产物〔pworRNA〕的核苷酸序列分类根据产物类型可分为蛋白质基因和RNA基因根据产物功能可分为结构基因和调节基因结构基因编码酶和不直接影响其他基因表达的prv调节基因阻遏蛋白和转录激活因子根据是否表达分外显子和内含子基因家族有些基因聚集在一起形成基因家族操纵子：原核生物中多基因聚集在一起形成的一种基因家族多基因家族：真核生物中多基因聚集在一起形成的一种基因家族，分简单基因家族和复杂基因家族。简单基因家族每个重复单元含有单一的转录区和非转录区，包含的基因是一致的。复杂基因家族每个重复单元含有多个转录区和非转录区，包含的基因是相似的。转座子：基因内存在的可转移的DNA片段能在同一细胞的不同染色体之间or同一染色体的不同位点之间转移，转移不依赖序列的同源性，且转移的是一个新copy。基因的精细结构基因是遗传物质的结构单位，不能由交换分开，交换只能发生在基因之间，而不是之中。基因是突变单位：基因可以从一个等位形式变成另一等位形式，但其内部没有可以改变的最小单位。基因是作用单位：能产生特定的表型效应，基因的一局部不能起作用。如质粒载体中插入的外源gene，使质粒某基因失活。染色体是基因的载体：染色体的存在使等位gene可以有规那么别离，又可使非等位基因相互重组。三、遗传密码子：mRNA上编码特定Aa的三个连续的核苷酸有64个，3个为终止密码子。遗传密码具有的特性：〔1〕不重叠，即密码子按三个一框读下去〔2〕无逗号，连续翻译各种Aa〔3〕起始密码AUGorCUG〔4〕终止子UAG、UAA、UGA〔5〕兼并性：n个密码子编码同一Aa〔6〕通用性：但并非绝对通用，如在线粒体中UAG不为终止子，编码Trp〔7〕可读性：由起始密码子到终止密码子，编码蛋白质的一套密码子四、基因表达Pro合成〔质粒、Aa、能源、ATPorGTP〕TranscriptiontranslationReplicateDNA——————RNA——————proteinTrans-transcription合成模板mRNA真核生物中mRNA为核不均一RNA即hmRNA，通过加工，选择性拼接而成成熟的mRNA〔即5’端帽，3’端尾，内含子去除〕原核生物中的mRNA直接以DNA为模板，以碱基互补方式构成，不经加工，故RNA边转录变翻译。〔二〕运输机器tRNA将活化的AA〔氨基酸—tRNA〕根据密码子要求运输。〔三〕装配机器rRNA其大小亚基构成一条容纳mRNA的通道，多个rRNA可同时装配一条多肽的合成。基因突变突变：指细胞内〔or病毒颗粒内〕遗传物质的分子结构or数量突然发生的可遗传的变化。突变是工业Bac育种的根底，但也是菌种退化的主要原因。突变的分子机制基因符号如何表示野生型和突变型的表现型和基因型呢？这是基因符号的命名原那么和表示方法问题。基因的统一命名为：某个基因的名称是根据该基因突变后的表现型效应来命名的，所有基因型名称均用三个小写的斜体字母来表示，而其后的大写斜体字母表示具体基因。所有的表现型均用三个正体的字母表示，其中首字母大写。表现型：具有合成or利用某种物质的能力，Sub+如Lac+〔利用乳糖〕缺乏合成or利用某种物质的能力，Sub-如Lac-具有对某种抗生素的抗性，Antr如Strr具有对某种抗生素的敏感性，Ants如Strs基因型：能够合成or利用某种物质的野生基因型，sub+能够合成or利用某种物质的突变基因型，sub-突变的subA基因subA-subA基因的63号突变具有温敏表型的subA基因突变每个基因座〔locus〕用斜体小写的三个英文字母来表示，这三个字母取自表示这一基因的特性的一个or一组英文的前三个字母。如组氨酸基因用his〔histidine〕产生同一突变表型的不同基因，在三个小写字母后用不同的一个大写斜体字母来表示。如，色氨酸基因用trp表示，各个色氨酸基因用trpA、trpB等表示。同一基因的不同突变位点在基因符号后用阿拉伯数字表示。如trpA的不同位点突变分别用trpA23、trpA46等来表示。如果突变位点所属的基因不确定，大写字母用一连串自负代替。突变性的基因符号用基因座符号加上加号or其他符号来表示，例如在基因符号的右上角加“+〞or“—〞，表示该基因功能存在缺陷，而加“r〞or“s〞表示对某物质的抗性和敏感性。基因表性和产物用相应的基因型的正写字母表示，其中第一个字母大写。例如乳糖发酵缺陷型的符号是lacZ-，其表型符号为lacZ-。二、突变的分类1、按突变方式〔or突变发生原因〕：自发突变、诱发突变2、按变化范围：染色体畸变、基因突变、基因重组与传递3、按表型：形态突变、生理生化突变、抗性突变、致病性突变三、基因突变〔就突变的分子机制分析突变的原因〕1、碱基置换：转换嘌呤or嘧啶之间的互换颠换嘌呤与嘧啶之间的互换2、移码突变：由碱基插入or缺失引起的整个遗传密码子读码错误。易位突变：DNA链上邻近密码子之间的碱基互换引起的突变or一个密码子失去一个碱基，而另一个密码子中又参加一个碱基造成碱基序列异常。四、染色体畸变指染色体结构有较大范围的变异1、缺失：指染色体去掉某一局部，该突变会造成遗传平衡失调，故往往有害。2、重复：指染色体个别区段重复增加，通常由同源染色体的非等位交换引起的，对表型的影响有两种情况。〔1〕剂量效应：即某一gene的copy数越多，表型效应越显著〔2〕位置效应：指因重复区段位置的不同而影响基因间的相互关系，使表型出现差异。3、到位：正常染色体的某区段断裂后，断裂的片段倒转180度，又重新连接，遗传物质没有丧失，但基因序列发生变化有两种形式，臂内倒位和臂外倒位，倒位造成染色体局部节段的位置颠倒，极性相反。4、易位：染色体上一区段断裂后，连接到另一条非同源染色体上的现象，有两种情况〔1〕相互易位：即两条非同源染色体之间相互发生局部交换〔2〕单向易位：即一条染色体的局部片段接到另一非同源染色体上。倒位和易位都无遗传物质交换，难出现新表型，但由于DNA损伤而隐形突变or死亡。染色体组变：由染色体数目发生变化而引起的变异。突变引起遗传性状变化一、突变引起的遗传性状的变化由碱基置换引起的变化有3种情况〔一〕同义突变和无义突变同义突变：DNA分子上的碱基变化引起密码子形成新的密码子。但这种密码子编码的Aa与原密码子所构成的Aa相同。如：CCU——CCC——CCA——CCG——prdine〔由于兼并性〕无义突变：突变后的密码子变为终止密码子，称为无义突变，〔UAG、UGA、UAA〕。通常在基因符号后面加写〔Am〕、〔Oc〕or〔Opal〕分别表示琥珀型、赭石型、乳石型三种突变，使转译中途停止，难以完成一条完整的多肽链的合成，这种肽链无活性。错义突变：该突变引起Aa顺序的变化，产生不同的生物表性。原因是由于碱基置换产生的密码子与原来不同。如：CUA——GUA。使Leu——Val。移码突变：由于通读框的改变而引起的protein上Aa顺序的改变〔非可信的碱基增加or减少〕改突变使多肽链上的Aa序列发生很大的改变，将出现明显的遗传性状差异，最终引起性状的变异，严重的会导致个体的死亡，如人类金银KCNN3113——1140缺失引起移码突变，可能引起精神分裂症。二、突变型的种类：根据突变的表型效应可分为以下几种：〔一〕形态突变型：是一种可见突变，如菌落形态变化，细胞形态改变，细胞结果变化等。〔二〕生化突变性：这里指的是营养缺陷型，糖类发酵突变株，色素形成突变株及有益代谢产物生产能力突变株。其实严格上讲，所有的突变都归于生化突变。〔三〕条件致死突变：该突变在允许条件下存活在限制条件下致死，用得最广的是温敏突变株。<1>热敏突变株：eg.大肠杆菌的一种温敏突变株在37C下正常生长，在42C却不能生长。<2>冷敏突变株：对低温敏感，具有比野生型高的最低生长温度温敏突变的原因是突变基因的编码产物对温度的稳定性降低，酶蛋白提高了对高温或低温的敏感性。<3>抑制敏感突变<脱敏突变>：在抑制基因存在时，能生长繁殖，而抑制基因消失时，就停止生长繁殖。如耐自身产物突变株〔抑制基因是抑制敏感物对菌体起作用〕<四>致死突变：由于基因突变而导致个体死亡的突变型叫致死突变型，通常可分为显性致死和隐形致死，杂合状态的现行致死和纯合状态的隐形致死都能导致个体的死亡，而在单倍体中两种类型都会导致个体的死亡，无法获得突变体。<五>产量突变型：所产生的代谢产物明显有别于原始菌株的突变株。产量高于原始菌株者为正突变菌株，反之为负突变株。产量突变型一般不易通过选择性培养基被快速筛选出。是由于产量的上下往往是有多基因控制的。<六>抗性突变型：由于基因突变而产生的对某种化学药物，致死因子或噬菌体具有抗性的变异菌株，突变前的菌株叫敏感型。抗性突变型包括抗药性突变型，抗噬菌体突变型，抗辐射突变型，抗高温突变型，抗高浓度酒精突变型，抗高渗透压突变型等。此类突变株往往可以通过在加有相应药物或物理因子处理的培养基上快速筛选出。细菌抗性的来源：1.突变2质粒的转移：细菌通过接触而转移产生抗性的质粒3生理适应：细菌因长期接触抗性因子而有暂时的抗药性能，但基因不发生改变。特点：a离开抗性因子时抗性消失b群体细胞都具有同一特性。突变体的形成突变体的形成过程<一>.诱变剂在DNA接触之前诱变剂：但凡能提高基因突变频率的因素，诱变剂的种类很多，包括物理因素，化学因素。一种诱变剂不一定只能引起一种类型的突变，诱变剂必须通过细胞壁，细胞膜，细胞质才能和DNA接触。这个过程会引起一些化学反响，受到各种因素的影响，如亚硝酸使DNA和氨基酸脱氨。这些因素都会影响改变效果，许多生物的细胞对辐射的杀伤和诱变反响各不相同，这根本上取决了细胞外表对诱变剂的通透性。通透性越大，诱变越容易，诱变率越高。<二>突变发生过程：诱变剂与DNA接触后是否发生突变，与DNA复制有关，而DNA复制到活泼程度与某些营养条件和细胞的生理状态有关。<三>突变体的形成：诱变剂和DNA接触后，发生化学反响，继而使得DNA上的碱基发生变化，产生突变，但突变到突变体的形成过程非常复杂，并不是所有的突变都形成突变株。当一个突变发生后，要经过复制才能形成突变体，在突变体前后过程中，生物细胞有一整套修复系统来修补还有一系列其他因素会可能使DNA结构复原。DNA损伤：指任何一种不正常的DNA分子结构，也称为前突变。非标准碱基的碱基衍生物在DNA链中会存在非标准碱基和碱基的类似物。Eg尿嘧啶〔U〕能在DNA复制时渗入，C〔胞嘧啶〕，A能自发脱氧基尿嘧啶和次黄嘌呤，此外各种诱变剂可是碱基成为碱基衍生物，如3-甲基腺嘌呤，嘧啶二聚体6-氢-5，6-2羟胸腺嘧啶等。其中最常见的是T~T这种二聚体会造成双螺旋局部变化氢键结合力显著减弱，这种二聚体在复制时如果以它为模板，会将两个腺嘌呤核苷酸加上去，但由于不能很好地形成氢键，会由3’-5’校对功能将之水解，而DNA复制毫无进展，因而产生一个空耗的过程，即大量的dATP被分解，而DNA复制毫无进展，由于DNA仍在不断地合成，而DNA不能复制，细胞也不能分裂，这样就出现细丝状的蛇形细胞，最后导致细胞死亡。碱基的丧失一般来说碱基的甲基化会破坏N-糖苷键。这样会使碱基脱落，形成无嘧啶，无嘌呤碱基位点即〔AP位点〕。此外，细胞类的各种糖基化酶也能产生AP位点。烷基化损伤很多烷化剂能将DNA中的嘌呤碱基特别是鸟嘌呤烷基化。链的断裂和交联许多理化因子能引起DNA的单链断裂和DNA的双链断裂尤其是电离辐射。〔X射线，快中子，r射线等〕，过氧化物，巯基化合物，某些金属离子以及ＤＮＡ酶都能引起ＤＮＡ链的断裂，某些抗生素，如丝裂霉素Ｃ和一些试剂如ＨＮＯ２能引起链内碱基的交联和链间碱基的交联。２.ＤＮＡ的修复细胞中ＤＮＡ作为遗传信息的载体，要求保持高度的精确性和完整性。在长期的进化过程中，生物体演化出了两套系统来保障ＤＮＡ平安的修复。一套是纠正偶然的复制错误的系统，另一套是修复体内外化学物质造成的ＤＮＡ分子损伤的系统。复制的修复ＤＮＡ聚合酶的校读功能ＤＮＡ聚合酶的校对功能对于ＤＮＡ作为遗传物质所必需的稳定性和极高的保真度至关重要。ＰＯＬ１和POL3都具有DNA聚合酶的活性，两者都具有3’-5’核酸外切酶的活性。POL1主要用于DNA的修复和RNA引物的替换，ＰＯＬ３主要使ＤＮＡ链延长。②.N-糖基酶修复系统对于DNA分子中的非标准碱基和碱基衍生物都是通过各自专一识别的N-糖基化酶来参与完成错误的切除修复。这个系统包括N-糖基化酶AP限制性内切酶，核酸外切酶，DNA聚合酶，ＤＮＡ连接酶。首先，在糖基化酶的作用下切开缺陷碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，释放缺陷碱基，形成一个AP位点，然后在AP核酸内切酶作用下，将AP位点的磷酸二酯键翻开，去掉不带碱基的磷酸脱氧核糖，最后在DNA聚合酶和连接酶作用下完成修复，〔US尿嘧啶-N-糖基酶系统为例〕此有图未打出③错配修复系统修复取出渗入DNA的碱基结构类似物和错误配对的碱基。DNA的错误配对一般有DNAploymerase的3’-5’校对功能立即修复，但也有些特殊情况。没有纠正而保存在DNA链上，这时错配修复系统对其进行识别，纠正，该系统包括错配矫正酶，DNA聚合酶和DNA连接酶。矫正酶是一个酶系统。由于MutS,MutH,MutL三种蛋白构成，这蛋白系统对错配位点识别并结合，形成复合物。DNA链通过该复合物双向滑动形成一个含有错配碱基在内的DNA环，蛋白复合物中的MutH切割甲基化的附近链形成一个缺口，被切割的DNA链在核酸外切酶作用下从断裂处开始朝错配位点进行降解，然后在DNApolymerase作用下以亲本链为模板合成新的DNA链。〔2〕损伤修复P26①光修复研究得最早的修复系统是紫外损伤的修复，DNA经UV照射后形成Ｔ－Ｔ光复活酶与之形成复合物，当复合物暴露在可见光下，酶被活化并将Ｔ－Ｔ分解成单体，Ｅｎ被释放。使ＤＮＡ链的缺口修复而恢复正常的ＤＮＡ双链结构。②切补修复〔复制前修复〕ａ．先切后补内切酶作用－外切酶作用－聚合酶合成新的片段－连接酶连接ｂ．先补后切内切酶作用－聚合酶作用－外切酶作用－连接酶连接③.重组修复〔复制后修复〕该修复只是使损伤的ＤＮＡ浓度相对变稀dsDNA-复制-重组-修复-产生两条dsDNA重组修复是非常重要的修复机制，它不必向切除修复那样需要等待很久后细胞的DNA才能复制，而是先复制在修复，重组修复还能修复某些不能被切除修复去除的损伤，比方某些损伤并不引起DNA双螺旋的变形，但确定阻碍复制的进行，但重组修复和正常的遗传重组并不是完全一致的，在这个系统中最关键的基因是recA。RecA具有催化DNA分子之间的固源联会和交换单链的功能。这个系统还需要recBCD基因，RecBRecCRecD是核酸外切酶V的亚基。RecA蛋白质，它不但具有重组活性而且还有单链DNA结合活性以及由此产生的蛋白酶活性。正是这种蛋白酶活性诱发了许多基因特别是修复系统基因的表达，其中包括切除修复系统，重组修复系统和SOS修复系统。④SOS修复依赖于recA基因的表达，损伤没有被转移或修复而是被容忍从而保持复制DNA的完整性，被破坏的碱基往往失去特殊的配对性。SOS是一种旁路修复系统从能量来源来看以上各种修复系统中只有光修复利用光能，其余利用ATP水解释放的能量，复制修复系统，光复活，切除修复，都是修复模板链，重组修复时形成一条新的模板链。ＳＯＳ修复是产生连续的子链，ＳＯＳ修复是唯一导致突变的修复，其余的修复机制是将损伤的ＤＮＡ恢复在到损伤前的状态或者是产生于亲本相同的子代ＤＮＡ。在诱变过程中，应参加某些化学物质抑制突变的ＤＮＡ修复，导致ＤＮＡ发生突变，如参加咖啡因，异烟肼，Ｔｒｐ后进行ｕｖ照射３．几个概念〔１〕正向突变回复突变和一致突变从突变的效应背离或返回野生型两种方向来讲可分为正向突变和回复突变正向突变：指改变了野生型形状的突变回复突变：使突变体所失去的野生型形状得以恢复的突变抑制突变：一个位点的突变抑制了另一个突变位点的表型效应使其回到野生型，该突变称为抑制突变。突变不是原位点回复突变而是第二位点突变原位点的突变依然存在１.基因内抑制突变：抑制发生在正向突变的基因中两种情况２.基因间抑制突变：抑制发生在其他基因中增变基因和突变热点增变基因：一与一基因的突变可以使整个基因组的突变率增高时，该基因为增变基因。如：ＤＮＡ聚合酶的３＇－５＇校对功能丧失或降低那么使突变率上升。ｒｅｃＡ基因突变。突变热点：突变频率高于平均数的位点称为突变热点，从理论上讲ＤＮＡ分子上每一碱基都能发生突变，但实际上突变位点并非完全随机分布，DNA分子上的各局部有着不同的突变率。前面讲的修复系统似乎能修复一切损伤，然而实际上当射线或化学物质作用是，还是会出现细胞大量死亡。原因：1、DNA产生了不可修复的损伤，如射线引起DNA双链在同一点断裂；2、修复系统本身受到损伤;3、修复系统被饱和，修复不了大量的损伤；4、修复引起的突变导致所产生的对细胞生存所必需的产物没有活性。二、突变的表型效应〔从突变到突变表型〕突变造成遗传性状改变，可能引起表型的变化，但并非所有突变都能产生此种效果，突变能否产生表型效应有以下几种情况：〔一〕突变不改变遗传性状，不引起表性效应；原因:同义突变，无义突变，沉默突变：新合成的Aa不是多肽的主要Aa；〔二〕显性突变和隐形突变的表型效应1、二倍体中纯合体的隐形等位基因〔aa型〕，显性或隐形突变都会引起表型效应，杂合体和纯合体的显性基因(即AA型)，只有显性突变才引起表型改变；2、单倍体中不管显性或隐形突变都会出现表型变化〔三〕突变的表型与环境1、环境的选择作用。基因突变会是细胞内原有的协调关系打乱，这种由突变而形成的新个体对原有的环境适应能力降低，故可能被环境淘汰，需调节适应它生长的环境；2、环境造就表型：在不同的环境下，微生物的基因型不发生变化，如菌株在不同的环境中的产抗水平不同，故对于突变株应提供适宜的生长环境；3、有些微生物突变后的表形随环境的变化而变化，如脉胞菌在有光照下为红色，反之为白色。综上所述：表型是基因型〔内因〕和环境综合作用的表现。四、表现延迟：突变产生的新的基因型个体能表现出来的遗传特性在当代出现，其表型的出现必须经过两代以上的繁殖复制。原因：1、诱变剂的路程效应，诱变剂引起DNA改变的时间落后于细菌当代繁殖的时间，诱变剂进入细胞的速度相当慢2、突变一般为隐性的突变，如果转移核细胞中所形成的是杂核细胞，隐性基因的表型只有经过细胞的几代繁殖，与细胞所有核都是含有突变基因时〔即核突变时〕才能表达出来，《别离性表现延迟》3、原有基因产物的影响，与基因发生突变后，细胞虽失去了产生这种功能的能力，但是原来堆积在细胞中的功能产物支撑其后代野生型的作用，突变型只有与原有的基因产物在子细胞的浓度逐渐随分裂稀释到最低限度才能出现。五、基因突变的规律所有的生物在遗传变异特征上都遵循着共同的规律，基因不管发生什么生物中也不管其突变带来的遗传信息改变的性质是什么，都符合同样的规律。1、基因突变的自发性突变可自发，抗性的发生与所抗因子的存在与否无关。如微生物抗药性的产生不是由于药物引起的。波动实验P23该实验说明，E.coli抗噬菌体抗性的突变不是由所抗的环境噬菌体诱导出来的。而是在它接受噬菌体前，这一突变发生得越早，那么抗性菌落出现得越多，反之那么越少。噬菌体只是起淘汰原始的未突变的敏感株的作用。影印实验由图可知，在三号培养皿中长出的抗链霉素菌落可在没有接触链霉素的2号平板中找到。并通过挑选抗性菌落，接种，涂布培养，重新接种影印培养等一系列过程使可获得大量的抗链霉素突变株。实验说明改抗性是在没有接触药物之前就存在的，是自发的，与链霉素的存在与否无关。链霉素只是起到了鉴别和筛选抗性菌株的作用。2、基因突变的随机性波动实验还说明了突变具有随机性，突变发生的时间是随机的。否那么甲组中各个小管间抗性菌落的数目不会有那么大的差异。突变的个体时间和基因都是随机的，也就是说在一个Bac群体中，对于cell而言，哪个cell将发生突变是随机的，且一个cell的突变不仅在时间和个体上上是随机的，而且在DNA的哪个位点发生也是随机的。但随机性并非说突变是没有原因或是不可知的。突变这一偶然事件的必然性表现在特定的突变率上，也就是说，突变总是以一定的频率在群体中发生。〔但DNA分子中各个部位有着不同的突变频率，存在突变热点。〕3、稀有性指在正常情况下，突变发生的频率往往很低，一般10-6.突变率：即在一个世代或其他规定的单位时间内，在特定的环境条件下，一个细胞发生某一次性状突变的概率，但基因中存在增变基因。4、基因突变的稳定性，即可遗传性突变是稳定的，一旦产生就能稳定的遗传，不会因抗性的消失而消失。5、独立性突变的发生具有独立性。在一个Bac群中，一个cell的突变与其他个体之间互不相关，并且某一个基因的突变和另一个基因的突变之间也是互不相关的。两个不同基因同时发生突变的频率为两个基因各自的突变率的乘积。交叉抗性：指细菌对两种抗生素等药物同时由敏感变为抗性。似乎与独立性相矛盾，其实不然，这主要是由于细胞内单一基因的突变导致Bac对结构类似或作用机制类似的抗生素均有抗性，从而表现为交叉抗性。6、可逆性：突变基因可通过再次突变回复到野生型，回复率同样很低。7、诱导性：突变频率可以通过某些理化因素的处理而大大提高，一般10——10的五次方倍。第五章工业Bac诱变育种剂诱变剂种类：物理诱变、化学诱变、生物诱变剂第一节物理诱变剂物理诱变剂又称为辐射，有非电离辐射类的紫外线，激光和离子束等。电子辐射类的X射线、R射线和快中子等。常用的有UV和R射线。一，物理诱变剂的生理学效应1.、辐射作用的原理：高能辐射UV热能导致生物系统损伤，继而发生遗传变异其变异率和死亡率与辐射剂量和人热能剂量有一定的相关性，一般来讲DSDNA断裂或SSDNA断裂。以SSDNA断裂居多。电离辐射引起基因突变和染色体畸变，非电离辐射主要形成T~T2作用过程：P35。图4.1辐射的过程可分为物理、物理_化学、化学和生物等几个阶段。当辐射处理生物细胞时，细胞首先接受能量，穿过CELLwall.Cellmemberance和DNA接触，产生一系列的化学变化从而使DNA发生改变，产生变异形成突变体。二．影响辐射生物效应的因素辐射引起生物效应的强弱，即取决于BAC内遗传因素，也受环境的影响。BAC的遗传背景:品系不同，对辐射的敏感不同，如AT含量越高，对ＵＶ越敏感。但对电离辐射时那么相反。ＢＡＣ生理状态：如孢子、芽孢、菌丝体对诱变的敏感不同，主要是由于Cellwall和它以外的结构对诱变剂的影响可见光：可消除UV的诱变效应水分：H2O能有助于产生自由基。故含水量低的Cell敏感性降低T.最适生长温度内。温度能增强辐射效应1：促进O2与自由基之间的反响2：加快反响速度O2、O2对电离辐射效应影响校大。O2充足、诱变效果好。由于O2能产生氧自由基三、非电离辐射——UV〔一〕诱变机制主要是由于它引起DNA变化造成的DNA强烈吸收紫外线1．ＤＮＡ链的断裂。2．DNA分子内和分子间的交联3．核酸与蛋白质之间的交联。4．Ｃ与Ｕ之间的水合作用５．嘧啶二聚体。其中绝大多数为Ｔ＝Ｔ。但也有Ｔ＝Ｃ和Ｃ＝Ｃ二聚体通常Ｔ＝Ｔ是DNA链上相邻的嘧啶之间交联而成的，二聚体形成后破坏A的正常参入复制在这一点上突然停止或错误进行以至在心形成的链上有一个改变了的碱基序列。〔二〕DNA损伤修复。1。共修复。2。切补修复。3。SOS修复5。DNA聚合酶的校正作用〔二〕紫外诱变1.诱变的有效光谱。200-300nm最有效的为2537A。15Ｗ紫外灯。３０Ｗ杀菌。2.诱变的辐射剂量〔1〕绝对剂量org/mm2(2)相对剂量a照射时间，在固定灯的灯率和灯管距离的情况下，照射剂量的大小与照射时间成正比关系照射时间长剂量大b.杀菌率。一般认为90%——99%3.诱变的步轴与方法〔1〕出发株活化。细菌——对数期。霉菌的放线菌——孢子刚成熟期使其处于最正确生理状态。对诱变剂敏感同时生存能力强〔2〕预培养。活能的菌株——接种到含有抑制剂DNA修复的物质〔或进同步培养〕〔3〕制备悬浮液。菌液——离化——生理盐水混匀——单细胞悬液〔4〕紫外照射〔5〕后代培养〔6〕稀释涂皿，别离纯化〔筛选〕〔四〕提高突变率的方法〔1〕诱变后马上涂布培养减少复制前修复。〔2〕添加修复抑制剂：如参加异烟肿。Trp酪素水解物等氧化性营养物质〔3〕诱变层马上放入暗处，防止光复活，但将培养物放入非生长条件下的暗处也会是致死率和突变率下降，这称为液体保存复活或暗修复。〔4〕诱变后，进入冰水中1-2小时。抑制修复酶的活性四.电离辐射1.作用原理：其高能量和穿透力可使H2O或其他一些分子电离而产生含有未配对电子的分解碎片。这些碎片能打断DNA链，并改变嘌呤和嘧啶碱基；当然，电离辐射对DNA的作用还未得出较完整的概念。X射线和V射线是电子流。光子是不带电的。故它不直接引起物质电离，只有与原子或分子碰撞时，把能量传递给原子而产生次级电子。这些次电子一般具有很高的能量。直接或间接改变ＤＮＡ结构，直接效应是造成ＤＮＡ断裂。间接效应是电离辐射从水或有机分子产生自由基。自由子作用于分子。２．种类：Ｘ射线、Ｒ射线、快中子、Ｂ粒子、ａ粒子３．电离辐射的剂量。快中子用rad表示。1radorg被照射物质吸收100org辐射能量的射线剂量。X射线和R射线用伦琴〔R〕表示，即1cm2枯燥空气在0摄氏度，1标准大气压下产生2.08X10〔9〕离子所需的能量。4.电离辐射的照射方法。1.直接对菌落照射。2.制备菌落悬液五.新型物理诱变剂1.微波：微波有热效应和非热效应我们希望的是非热效应，在辐射过程中采用分散低温枯燥法。消除其热效应2.红外线。作用机制目前不明确。主要与UV联用。可提高突变率3.激光激光视一种光量子流，可以通过闪、热、压力、和电磁场效应的综合作用。直接或间接地影响生物体引起DNA发生变化。4.高能电子流：是较强的电离辐射，诱变剂量一般为90%——99%杀菌率5.离子注入离子注入的技术原理是用能量为100Kev量级的电子束入射到材料中去离子束与材料中的原子或分子将发生一系列物理和化学的相互作用，入射离子逐渐损失能量，最后停留杂材料中。并引起材料外表成分。结构和性能发生变化，从而优化材料外表性能，或获得某些新的优异性能。优点：1、不但有能量沉积，而且还有质量沉积〔即：既能产生能量转移，又能生成新的分子〕。故可与生物体作用得到高的突变率且突变谱广。死亡率低正突变率高。2、离子注入通过不同电荷数、质量数、能量和剂量的组合。可提供众多的诱变条件。这些电、质/、能的联合作用，可强烈影响生物体的生理生化特征，并引起基因突变。3、具有作用区域的选择性。种类的多样性。其作用是局部的可对生物体实行定点区域诱变4、存效、方便、平安无污染第二节化学诱变剂化学诱变剂：一类对ＤＮＡ起作用。改变其结构。并引起遗传变异的化学物质根据作用方式可分为碱基类似物，移码突变剂，碱基修饰剂〔烷化剂、脱氧剂、羟化剂〕和其他种类剂量的控制主要取决于浓度和作用时间碱基类似物：指和DNA结构中天然的嘧啶、嘌呤四种碱基在分子结构上相似饿一类物质如5-BUT的结构类似物。2-AP是Ａ的结构类似物在ＤＮＡ复制时，它们可以被错误的掺入到ＤＮＡ中。引起诱变效应。〔一〕诱变机制碱基类似物的诱变机制是通过互变异构表达象实现的以５－ＢＵ为例加以说明〔Ｐ４３〕嘧啶具有酮式和稀醇式。嘌呤具有氧基状态和亚氨基状态。5-BU代替T参加到ＤＮＡ中。酮式与A配对。稀醇式与G配对引起正突变的机制〔正常掺入。错误复制〕？？？、、——Ａ＝ＴA=T——A=T——A=BU——第二次复制G〔三横〕C——第一次复制BU〔三横〕G〔稀醇式〕——A-BU引起四复制突变的机制〔错误掺入，正常复制〕5—BU掺入——G〔三横〕CG〔三横〕C————G〔三横〕C——G〔三横〕Bu——第一次复制——A=T——A—BU————A=BU注意：只有多Cell中缺少T时，BU才可以取代T掺入故培养时去T才能引起突变又如2—AP。能与T配对形成T=AP。会与C配对引起A=T——G=C突变图略碱基类似物必须经过两代以上繁殖才能表现出来且引起的诱变是通过DNA复制来实现的。所以它只对正在新城代谢和繁殖的Bac起作用。对休眠CeLL和脱离菌体无作用。〔二〕碱基类似物的诱变处理方法1.单独处理出发株活化——培养至对数期——洗涤饥饿培养〔消耗体内贮存的物质〕——参加碱基类似物质——后培养——筛选2．与辐射线复合处理。参加碱基类似物以后，参加一些DＮＡ修复抑制剂培养一定的时间使其渗入到ＣｅＬＬ中。再用辐射线处理后，将其培养二．碱基修饰剂〔一〕烷代剂具有一个或多个活性烷基，此烷基能转移到其他分子中。易取代DNA中的活泼H原子，直接与一个或多个碱基及磷酸局部反响，使其被烷化。从而改变DNA分子结构，使DNA复制时导致碱基错配而引起突变。碱基中最容易发生活化的是嘌呤类，其中鸟嘌呤NT是最易引起反响的位点，烷化剂有单功能的如亚硝基类、磺酸脂类、硫酸酯类重氮烷类和乙烯亚胺类。双功能烷化剂那么有硫荠子类，多功能指烷化剂带三个以上的活性烷基1、作用规律〔1〕双功能的或多功能烷化剂毒性大致死率高、诱变效果差。此种烷化剂除了有单功能的烷化剂的作用外很容易引起交联反响使ＤＮＡ断裂〔2〕大基因的烷化剂的反响速度比小基团的要快，毒性大，死亡率高，诱变效果差。如，乙基烷化剂比甲基烷化剂的效果差。2、烷化剂的作用机制烷化剂的诱变机制比拟复杂，有的还未完全弄清但是碱基转换引起错误配对时造成基因的主要原因1.的错误配对。如G数易受到烷化作用形成T—烷基鸟嘌呤，并与错误配对。使GC转为AT如T被烷化后使AT转化GC2.引起ＤＮＡ分子中磷酸和糖之间的共价链发生断裂。发生脱碱基作用，形成AP位点这种位点一般被N—糖基酶修复系统。但没有被修复的会采用SOS修复这样就带来了突变3．是两个G的N个位点形成共价键。形成G_G4．一般双功能烷化剂易引起ＤＮＡ双链间的交联，形成变异或死亡５．可能造成染色体畸变3、烷化剂的性质：活泼不大稳定，水溶液中易水解，大局部烷化剂的半衰期短且其长短与Ｔ、ＰＨ有关。常用的有亚硝基胍〔ＮＴＧ〕。甲基磺酸乙脂〔EMS〕硫酸二乙酯〔PES〕乙烯亚胺氮荠体。NTG或NG理化性质：不溶于水。黄色晶状物质。见光分解诱变性质:起诱变剂。使Cell发生一次或屡次突变或使多基因并发多为作用于营养缺陷性诱变诱变机制PH<5.5时NG——HNO3PH>7.8时NG——CH2N2PH=6NG本身与DNA发生烷化反响诱变方法A、菌悬浮液法菌株活化——菌悬浮液+NG——保湿生长——终止反响——后培养——别离终止方a冷的生理盐水稀释b低温离心洗涤B、摇匀振荡处理：菌株活化——液体培养至最正确状态——DNA和乳化剂——后培养——别离C、平面生长处理——菌种活化——接种到NG平板上——后培养其他的烷化剂〔自学0〔二〕脱氧剂亚硝酸HNO2是典型的脱氧剂。〔1〕诱变机制：碱基脱氧但凡含有NH2的碱基〔AGC〕都能被HNO2作用产生氧化脱氨反响是—NH2基团变成酮基改变配对性质，造成碱基转换突变Ａ——H次黄嘌呤H与Ｃ配对使AT——ＧＣＣ——UＵ与A配对使ＧＣ——ＡＴＧ——Ｘ黄嘌呤Ｘ与G配对不发生转换〔2〕使DNA两条链之间发生交联作用，阻碍双链的分开，从而影响DNA复制引起确实突变〔3〕处理方法菌悬液〔孢子悬液〕——NAＮＯ２＋醋酸ｂｕｆｆｅｒ——保温突变——参加PH8NA2HPO4溶液ＰＨ至６．８终止反响——后培养——稀释别离〔三〕羟化剂羟氨是一种典型的羟化剂具有特异诱变效应能专一性诱发ＧＣ——AT的转换。对噬菌体及离体ＤＮＡ专一性更强诱变机制与PH和浓度有关PH6.0专一性与C反响使C羟化后与Ａ配对引起ＧＣ——ＡＴ转换浓度０．１-1MPH９．０与U反响使其羟化〔翻译过程中受损0浓度10的付三次方PH9.0其产物与ＴＧ反响引起其羟化与Ｃｅｌｌ中其他物质作用产生H2O2t通过H2O2引起突变〔四〕移码突变剂移码突变剂是一类能够嵌入到ＤＮＡ分子中的物质如吖啶类化合物，主要用于质粒的脱落包括元黄素吖啶黄素；溴化乙锭和一系列ＩＣＲ类化合物〔一类由烷化剂〕和吖啶类结合而形成的化合物。诱变机制：移码突变剂嵌入到DNA分子中，使相邻的两个碱基之间距离拉宽，迫使DNA分子的长度增加。复制过程中随着双螺旋伸展或解开一定的长度造成阅读框的滑动，由于子代DNA分子上减少或增加一个或数个碱基，假设增减的碱基数缺乏3的倍数，就会引起密码转录翻译错误，导致移码突变。移码诱变的嵌入并不导致突变，必须通过DNA的复制才能形成突变，是一种低效诱变剂，诱变方法可以是平皿生长法或液体培养法，即在培养基中参加诱变剂培养：〔五〕、金属盐类Licl、Alcl3、Mgso4、但一般为助诱变剂〔六〕、其他诱变剂1、秋水仙碱：多倍体诱变剂，破坏纺锤体形成。2、抗生素、丝霉素、链黑霉素等，但一般与其他诱变剂联用第三节生物诱变剂噬菌体：一般是溶源性的，引起抗噬菌体突变株的出现。基因诱变剂：用特定的核苷酸序列作介导，将有精确的点突变的核苷酸导入宿主细胞中，使之在一定的条件下引起基因突变，该特定的带有突变位点的核苷酸叫做基因诱变剂。局限性：只能对天然蛋白质的某些Aa进行替换，而高级结构根本不变，因此对基因的改造非常有限。种类：按诱变方式目前可以分为以下几类转导诱发突变剂2、转化诱发突变剂3、转座诱发突变剂工业Bac产生菌的别离筛选菌种的来源：1、购置2、自然别离筛选3、从发酵产品中别离筛选工业Bac筛选包括：1、从自然界中别离所需菌体2、把得到的菌进行别离纯化，并进行子代产物鉴别。步骤：一般为采样——富集——别离——筛选——性能鉴定含Bac样品的采集在采集Bac样品是，要遵循的一个原那么是：材料来源越广泛，就越有可能获得新的菌种。从土壤中采样土壤中Bac含量规律：细菌＞放线菌＞霉菌＞酵母＞藻类＞原生动物细菌〔十的八次方每克〕、放线菌〔十的七次方每克〕、霉菌〔十的六次方每克〕、酵母〔十的五次方每克〕、藻类〔十的一次方每克〕、原生动物〔十的负一次方每克〕根据土壤特点土壤有机质和通气状况①森林土适合霉菌、酵母；②耕作土通气良好，有机质丰富，适宜放线菌、细菌。土壤PH和植被状况①：PH7.0—7.5放线菌、细菌；②：PH＜7.0霉菌、酵母。3、地理条件：南方＞北方4、季节条件：南方秋季5、采样方法：5—25cm处的土样北方10—30cm二、根据Bac的生理特点采样1、根据Bac的营养类型：面粉广含淀粉适合利用淀粉作为营养物质的淀粉酶产生菌生长。森林中含有纤维素，适合利用纤维素作为营养物质的纤维酶产生菌的生长。2、根据Bac的生理特点：如高温酶产生菌、低温酶产生菌、耐压菌的采样等。第二节．含Bac样品的富集培养富集培养：根据Bac生理特点，创造最适的生长环境，使目的Bac迅速生长繁殖成为优势菌种，又称施压培养，主要是根据C,N,pH,T,O2等生理条件的控制。一、控制培养基的营养成分。常用的有三种方法1、人为地参加相应的底物作为唯一C或N源，哪些能快速分解利用该C,N源的菌得到充足的营养而迅速生长。其他菌受到生长限制，要注意的是能在该培养基上生长的Bac不是单一的菌落，而是营养类型相同的菌群，如在培养基参加淀粉作为唯一C源，筛选淀粉酶产生菌。2、根据Bac不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基常用于丝状菌的增殖。3、对于用于降解污染物的环保菌的别离，可用参加污染物作为唯一C，N源的方法的连续培养基。控制培养条件，主要是对pH，T,O2等一些条件的特殊要求加以控制。抑制不需要的菌种，通过高温，高压，参加抗生素等方法减少非目的菌种的数量。如别离芽孢杆菌时，先在80度下加热20分钟或50%的乙醇浸泡一小时，杀死营养型细胞。别离孢子时，先在50度下加热20分钟或50%的乙醇浸泡一小时，杀死营养型细胞。别离霉菌时，参加四环素来抑制细菌。别离放线菌时，参加青霉素〔抑制G+〕，链霉素〔抑制G-〕，制霉素〔抑制霉菌〕。第三节Bac别离富集后的培养基仍然有多种Bac混杂在一起，即使占了优势的类Bac，也并非纯种。好氧菌Bac的别离别离方法的分类1.菌落纯2.细胞纯稀释涂布法得到单菌落的时机大划线别离法该法操作简单，效果较好利用平皿的生化反响进行别离根据Bac特殊的生理特性，或利用给某些代谢产物的生化反响来别离目的菌。可显著提高菌株的别离纯化的效率1：透明圈法用于别离水解酶产生菌，在培养基中〔平板培养基〕参加溶解性差的底物使培养基浑浊，能分解底物的Bac便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反响了该菌株利用底物的能力。如别离脂肪酶，淀粉酶，蛋白酶，核酸酶产生菌。2：变色圈法对于不易产生透明圈的产生菌，可在底物平板中参加指示剂或显色剂，主要利用指示剂或显色剂的选择反响。如果胶酶产生菌——刚果红〔变成绛红色〕，谷氨酸产生菌——溴百里酚〔pH<6.2黄色，pH>7.6蓝色〕，脂肪产生菌——尼罗蓝〔以吐温为底物，咖啡色——蓝紫色〕，脂肪产生菌——维多利亚蓝〔起初培养基中性，粉红——蓝；起初培养基碱性，咖啡色——蓝绿色〕3:生长圈法用于别离筛选氨基酸，核苷酸和维生素的产生菌，要与工具菌一起涂布，工具菌是一些相应的营养缺陷型，目的Bac周围会有工具菌的生长。4：抑菌圈法用于抗生素产生菌的筛选，也要与工具菌一起涂布培养工具菌是对抗生素相应的敏感菌，目的Bac周围无工具菌的生长。〔四〕组织别离法从一些病变或特殊组织中别离菌株的方法1、对一般病变组织的别离方法切除小块含菌组织——冲洗——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2-5分钟消毒——冲洗——培养——平板纯化——斜面培养2、食用菌的孢子别离法子食体外表处理：1外面有膜包被的用0.1%-0.8%升汞浸泡2-3分钟消毒2外面无膜包被的用75%的酒精浸泡2-3分钟消毒多孢子别离法：收集孢子并进行培养，移植菌丝培养单孢子别离法：收集与培养别离。先收集孢子，然后在平板上〔马铃薯，蔗糖培养基〕进行单孢子别离。单细胞的单孢子别离法1.凹玻片别离法2.滤纸别离法〔自学〕控制培养条件进行别离，与前面讲的大同小异，根本上只控制营养条件，pH，T和抑制不需要的菌类。厌氧菌的别离培养过程中除氧的方法加复原剂Cys〔半胱氨酸〕，D型维生素c，硫化钠等焦性没食子酸法利用其与氢氧化钠反响除去氧气平皿气厌平培养法〔其实也是焦性没食子酸与氢氧化钠反响〕试管压气法〔其实也是焦性没食子酸与氢氧化钠反响〕玻璃板隔绝空气法〔以美蓝为指示剂〕，蓝色代表缺氧生物吸氧法利用发芽的燕麦吸氧，使其处于缺氧状态第四节野生型目的菌株的筛选和鉴定一．初筛平板筛选：可根据水解圈，变色圈，抑菌圈等方法，挑选菌落——含目标底物的平板上培养摇瓶发酵培养由于摇瓶振荡培养更接近于发酵罐，培养的条件较一致，由此筛选到的菌株易于推广。菌落——摇瓶——培养——检验二．复筛摇瓶培养，但一般为了提高速度与琼脂平板法和精确的经典检测相结合三.菌株鉴定1.分为三个步骤〔1〕培养获得该Bac的纯种培养物；〔2〕测定一系列的必要鉴定指标，如形态，特征，生理生化遗传特征等；〔3〕根据权威性的而鉴定手册进行菌种鉴定。2．四个水平〔1〕细胞形态和习性水平即形态特征，运动性，酶反响，营养要求，生长条件；等条件〔2〕细胞组分水平：如细胞组分，脂类，细胞色素等；〔3〕蛋白质水平：如氨基酸顺序等；〔4〕DNA的基因水平。如核苷酸序列。第七章工业Bac诱变育种一、概述1、诱变育种：利用物理和化学等因素，人为地对出发菌株进行了诱变处理，然后用合理的筛选程序及适当的筛选方法把符