导数分光光度法

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臧晓欢化学分析与仪器分析方法比较化学分析(Chemicalanalysis)：常量组分(>1%),Er

0.1%～0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器

仪器分析(Instrumentalanalysis)：微量组分(<1%),Er

1%～5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准滴定法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法结果0.048%～0.052%,满足要求准确度高灵敏度高

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臧晓欢10.1物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律10.1.1物质对光的选择性吸收

吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法等。特点：灵敏度高（测定下限可达10-5～10-6mol/L）准确度高（满足微量组分的测定要求：RE:2～5％(1～2％)简便快速

（在适当条件下，不经分离可直接测定）应用广泛（无机、有机成分、农药残留、生物体内的微量成分、药物分析、环境卫生分析）。

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臧晓欢

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臧晓欢光的基本性质光的电磁波性质

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光近紫外：200-400nm人眼所能感觉到的波长范围400-750nm近红外：750－2500nm

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臧晓欢可见光色散红橙黄绿青青蓝蓝紫650-750

nm600-650

nm580-600

nm500-580

nm490-500

nm480-490

nm450-480

nm400-450

nm单色光:单一波长的光复合光:由不同波长的光组合而成的光

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臧晓欢单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。白光青蓝青绿黄橙红紫蓝物质对光的吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光

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臧晓欢

物质对光的选择性吸收

吸收(absorption):一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长(wavelength)的光而让未被吸收的光透射过，即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现的是它吸收光的互补光的颜色。例如，KMnO4溶液选择吸收了白光中的绿色(500~560nm)光，与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液，所以KMnO4溶液呈现紫色。

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臧晓欢

吸收光谱产生的原理

物质分子内部六种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动Ee；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动Ev；（3）分子本身绕其重心的转动Er；（4）原子的核能En；（5）分子的平动能Et；（6）基团间的内旋转能Ei。

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臧晓欢分子吸收光谱-带状光谱(molecularabsorptionspectrum-Bandspectrum)→由电子能级跃迁而产生吸收光谱Ee[能量差在1~20(eV)]，是紫外及可见分光光度法(UV/VisSpectrophotometry)→由分子振动能级Ev

(能量差约0.05~leV)和转动能级Er

(能量差小于0.05eV)的跃迁而产生的吸收光谱，为红外吸收光谱(InfraredSpectrophotometry)。用于分子结构的研究。

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臧晓欢分子的能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量ΔEe(1~20eV)>ΔEv

(0.05~1eV)

>ΔEr(0.005~0.05eV)在紫外光的照射下，En不变，Et和Ei较小。所以，体系吸收能量而发生跃迁时：

△E=△Ee+△Ev+△Er

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臧晓欢电子能级的跃迁

当用可见光或紫外光照射分子时，价电子可以跃迁产生吸收光谱，在电子能级变化的同时，不可避免地伴随分子振动和转动的能级变化。因此他包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。

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臧晓欢S2S1S0h

A

h

h

h

分子内电子跃迁带状光谱分子吸收光谱-带状光谱(molecularabsorptionspectrum-Bandspectrum)

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臧晓欢纯电子能态间跃迁S2S1S0S3h

E2E0E1E3锐线光谱

A原子吸收光谱Atomicabsorptionspectrum

由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的，为线状光谱(Linespectrum)。

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臧晓欢吸收光谱的获得

AbsorptionSpectra测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（

）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。(a)(b)(c)(d)

220240260280

nm

A0000(a)联苯（己烷溶剂）；一些典型的紫外光谱(b)苯（己烷溶剂）；(c)苯蒸汽；(d)Na蒸汽。

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臧晓欢

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臧晓欢吸收曲线(absorptionspectrum)的讨论：1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长(

max)2）同一物质不同浓度的溶液，光吸收曲线形状相似，其最大吸收波长不变；但在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增加而增大。这个特性可作为物质定量分析的依据。在实际测定时，只有在λmax处测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据。3）不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。光吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依据。

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臧晓欢定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础ABA

在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。A

C增大

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臧晓欢10.1.2光的吸收基本定律——Lambert-Beerlaw透光率（透射比）Transmittance透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It

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臧晓欢(1)Lambert-Beerlaw

当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。如图所示，设入射光强度为I0,吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。I‘0I‘rI‘tI‘a光吸收的基本定律朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比

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臧晓欢Lambert-Beerlaw入射光强度透射光强度透光度吸光度摩尔吸光系数：L·mol–1·cm-1溶液厚度溶液浓度其物理意义：一定温度下，一定波长的单色光通过均匀的、非散射的溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和厚度的乘积成正比。

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臧晓欢2）吸光系数(Absorptivity)a的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，

A＝abc

的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，用

表示.

－摩尔吸光系数(Molarabsorptivity)

A＝

bc

当c的单位用g·(100mL)-1表示时，用表示，A＝bc，叫做比消光系数

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臧晓欢3）吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系ATcA=kbc线性关系

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臧晓欢吸收定律与吸收光谱的关系AC吸光定律A

吸收光谱A

C

max

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臧晓欢

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臧晓欢吸光度与光程的关系A=

bc

检测器b样品光源0.22吸光度光源检测器0.00吸光度光源检测器0.44吸光度b样品b样品

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臧晓欢

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臧晓欢吸光度与浓度的关系A=

bc

吸光度0.00光源检测器

吸光度0.22光源检测器b

吸光度0.44光源检测器b

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臧晓欢摩尔吸光系数()的讨论1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数；2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时,ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；3）同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。

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臧晓欢4）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104

：高灵敏；

ε<2×104：不灵敏。5）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。Lambert-Beerlaw的适用条件1)单色光:

应选用

max处或肩峰处测定2)吸光质点形式不变：离解、络合、缔合会破坏线性关系，应控制条件(酸度、浓度、介质等)3)稀溶液：浓度增大，分子之间作用增强

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臧晓欢

例

有一浓度为1.0μg•mL–1的Fe2+溶液，以邻二氮菲显色后，用分光光度计测定，比色皿厚度为2.0cm，在波长510nm处测得吸光度A=0.380，计算该显色反应的吸光系数a和摩尔吸光系数ε。解：已知

b=2.0cmA=0.380铁的摩尔质量M=55.85g•mol–1(1)Fe2+的浓度用g•L–1表示时，c=1.0×10–3g•L–1吸光系数a==1.9×102L•g–1

•cm–1

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臧晓欢(2)Fe2+的浓度用mol•L–1表示时，

摩尔吸光系数例

有一浓度为1.0μg•mL–1的Fe2+溶液，以邻二氮菲显色后，用分光光度计测定，比色皿厚度为2.0cm，在波长510nm处测得吸光度A=0.380，计算该显色反应的吸光系数a和摩尔吸光系数ε。

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臧晓欢例:某有色溶液在2.00cm比色皿中，测得透光率T=50.0%，若改用1.00cm比色皿时，其T1和A1各为多少？解：有色溶液在2.00cm比色皿中的吸光度为：

A=–lgT=–lg0.500=0.301根据朗伯—比尔定律，吸光度与液层厚度成正比，则改用1.00cm比色皿时，其A1和T1各为：A1=1/2A=0.150由于A1=–lgT1

则

T1=10-0.15=0.708=70.8%

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臧晓欢(4).吸光度A具有加和性。溶液中有几种吸光物质，彼此间不发生化学反应，则可：

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臧晓欢(5).Sandell(桑德尔)灵敏度

(S)定义：截面积为1cm2的液层在一定波长或波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的量。用S表示，单位：

g·cm-2A=

bc=0.001

bc

＝0.001/

S小灵敏度高;

相同的物质,M小则灵敏度高.变换单位:bcmcmol/L=bcM106

g/1000cm2

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臧晓欢解：

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臧晓欢10.2.1分光光度计的组成光源单色器样品池检测器读出系统10.2分光光度计

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臧晓欢常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段

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臧晓欢紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯，氘灯，185~350nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置(比色皿)用于盛待测及参比溶液。玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便

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臧晓欢

分光光度计的主要部件1.光源(Lightsource)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)2.单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便

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臧晓欢

单色器①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝：

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臧晓欢单色器棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400

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臧晓欢光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.

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臧晓欢光栅

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臧晓欢分光光度计内部光的传播途径

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臧晓欢光路示意图

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臧晓欢3.吸收池(cell):用于盛待测及参比溶液。玻璃—能吸收UV光，仅适用于可见光区石英—

不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4.检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。

光电池，光电管，光电倍增管

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臧晓欢检测器硒光电池

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臧晓欢光电管红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nmNi环（片）碱金属光敏阴极h

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臧晓欢光电倍增管（160-700nm）待扫描1个光电子可产生106～107个电子

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臧晓欢光电倍增管

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臧晓欢5.指示器(display)

低档仪器：刻度显示

中高档仪器：数字显示，自动扫描记录

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臧晓欢

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臧晓欢

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臧晓欢

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臧晓欢

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臧晓欢10.3显色反应及影响因素要求：a.选择性好干扰少，易消除，吸收峰远b.灵敏度高

(ε>104)c.产物的化学组成稳定d.化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别

(

l>60nm)f.显色反应的条件要易于控制重现性好没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－显色反应1显色反应Colorreactions

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臧晓欢1)生色团（发色团）

能吸收紫外-可见光的基团

有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁,跃迁E较低注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强O－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe2.显色剂(Colorreagents)无机显色剂:[Fe(SCN)]2+，[TiO·H2O2]2+有机显色剂:

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臧晓欢2)助色团本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2——X

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臧晓欢3)红移和蓝移

由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后，吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移(Bathochromicshift);吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移(Hyptochromicsfift).4)增色效应和减色效应

增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应5)强带和弱带

εmax

>105→强带(Strongband)εmin

<103→弱带(Weakband)

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臧晓欢有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸

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臧晓欢络合反应氧化还原反应显色反应类型

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臧晓欢离子缔合反应成盐反应褪色反应

Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸吸附显色反应达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色

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臧晓欢3多元络合物混配化合物

Nb-5-Br-PADAP-酒石酸

V-PAR-H2O离子缔合物

AuCl4--罗丹明B金属离子-配体-表面活性剂体系

Mo-水杨基荧光酮-CTMAB

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臧晓欢10.3.2影响显色反应的因素a溶液酸度（pH值及缓冲溶液）

影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl

影响待测离子的存在状态，防止沉淀影响络合物组成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响例，磺基水杨酸–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色

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臧晓欢实际工作中，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。pH1<pH<pH2pH

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臧晓欢b.显色剂的用量

M(被测组分)+R(显色剂)=MR(有色络合物)

为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。

c(R)c(R)c(R)实际工作中，作A~CR

曲线，寻找适宜CR范围。

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臧晓欢c.显色反应时间:有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间.Att由实验确定。显色后，至少应保持到测定工作做完。

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臧晓欢d.显色反应温度：显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。

实际工作中，作A~T

曲线，寻找适宜反应温度。ATATATATAT

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臧晓欢e.溶剂：有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。f干扰离子消除办法：提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态选择合适参比

褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰)

选择适当波长

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臧晓欢10.5吸光光度分析及误差控制

为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”（maximumabsorption）。选用这种波长的光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。但是，在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应根据具体情况选择入射光波长。1.测量波长的选择

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臧晓欢(1)“最大吸收”原则—无干扰，选择

max为测量波长(2)“吸收较大，干扰最小”原则—有干扰，选择不受干扰的次强吸收波长为测量波长A

A

1）非单色光影响小2）灵敏度高

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臧晓欢例丁二酮肟光度法测钢中镍，络合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为470nm，但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在470nm处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选择波长520nm进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。

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臧晓欢—选择适当的测定波长——例子515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂

/nm

/nm

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臧晓欢2.

参比溶液的选择利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。原则：扣除非待测组分的吸收A（样）

=A（待测吸光物质）

+A（干扰）+A（池）A（参比）

=A（干扰）+A（池）

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臧晓欢1)仅络合物有吸收，溶剂作参比。

如phen—Fe2+

标准曲线2)待测液也有吸收，被测液作参比。

如测汽水中的Fe3)显色剂或其它试剂也有吸收，空白溶液作参比

例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4)干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：(1)掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比溶液.(2)加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比溶液.

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臧晓欢以显色反应为例进行讨论M+R=

M-R

max试液 显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测M-R的吸收

max

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臧晓欢ACCxAx

根据光的吸收定律:吸光度与吸光物质的含量成正比，这是光度法进行定量的基础，标准曲线就是根据这一原理制作的。

具体方法为:在选择的实验条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。

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臧晓欢*有时标准曲线不通过原点。可能是由于参比溶液选择不当，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。若有色络合物的解离度较大，特别是当溶液中还有其他络合剂时，常使被测物质在低浓度时显色不完全。找出原因，加以避免。

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臧晓欢10.4.2引起偏离朗伯－比耳定律的因素（一）物理因素AC原因：1.非单色光；

2.非平行入射光；

3.介质不均匀1.非单色光（仪器本身所致）

仪器使用的是连续光源，用单色器分光，由于单色器色散能力的限制和出口狭缝要保持一定的宽度，所以我们不可能得到纯的单色光，使分离出来的光具一定的谱带宽度。

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臧晓欢入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状

克服非单色光引起的偏离的措施使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的“单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。

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臧晓欢3.介质不均匀散射、假吸收。克服方法：避免溶液产生胶体或浑浊2.非平行入射光导致光束的平均光程b’大于吸收池厚度b，实际测得的吸光度大于理论值，产生正偏离。

入射光会因散射而损失，导致T减小，实测的A偏高

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臧晓欢（二）由于溶液本身的化学反应引起的偏离溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。A解离大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱)解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。B络合显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。

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C缔合例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯－比尔定律的偏离。

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臧晓欢（三）干扰及消除a.干扰干扰物本身有色或与显色剂显色，+干扰干扰物与M、N反应，使显色不完全，－干扰b.消除控制酸度，使M显色，干扰不显色氧化还原，改变干扰离子价态掩蔽校正系数参比液：可消除显色剂和某些离子的干扰选择

测，可避开干扰的吸收增加显色剂用量，将干扰灌饱分离

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臧晓欢10.4.3吸光度测量的误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大

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光度计的读数误差一般为0.2～2％(ΔT),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的ΔT引起的误差不同。100806040200T%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率读数误差

c

c1c1

c2c2

c3c3><

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臧晓欢仪器测量误差

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臧晓欢浓度测量的相对误差与T(或A)的关系1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434A＝0.434，T＝36.8%

时，测量的相对误差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相对误差<4%

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臧晓欢一、目视法c4c3c2c1c1c2c3c42.特点：简单、可测微量，复合光，误差大。观察方向观察方向1.方法：1910.5其它吸光光度法

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臧晓欢二、示差吸光光度法

普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量过高或过低时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则：Ax=εbcx，

As=εbcsΔＡ=Ａx

－Ａs=εb(cx

－cs

）=εbΔc

测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx

：cx=cs+Δc

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臧晓欢示差法标尺扩展原理：

普通法：

cs的T=10%；cx的T=5%

示差法：

cs

做参比，调T=100%

则：cx的T=50%；标尺扩展10倍

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臧晓欢三、双波长分光光度法

不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。

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臧晓欢双波长分光光度法ΔA＝Aλ2

－Aλ1

＝(ελ2

－ελ1)bc

两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度c成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合

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臧晓欢

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臧晓欢基本要求：⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2

－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。

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臧晓欢双波长分光光度法消除干扰在

2，A2

=

Ax2+Ay2在

1，A

1=

Ax1+Ay1

A=A2

-

A

1

=

Ax2+Ay2

–(Ax1+Ay1)

=

Ax2–Ax1

=AxAy2

＝Ay1

Ax=(

x2－

x1)bcx消除了y的干扰X被测Y干扰

2

1

1Ay1AX1Ay2AX2A/nm´

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臧晓欢双波长分光光度法消除浑浊背景干扰

1

2AA

1-A

2=△A

△A∝c例牛奶中微量Fe的测定

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臧晓欢四、导数分光光度法（自学）

导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。

利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析：

Ｉ＝Ｉ0e-εbc假定入射光强度Ｉ0在整个波长范围内保持恒定：

dI

0/dλ＝0则：dI/dλ＝－Ｉ0

bce-εbcdε/dλ

＝－Ｉ0

bcdε/dλ

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臧晓欢导数分光光度法dI/dλ

＝－Ｉ0

bcdε/