第七章微生物的遗传变异和育种

菌种的衰退、复壮和保藏Microbiology

Microbiology

性状稳定的菌种生产或科研正常进行的前提：这是微生物学工作最重要的基本要求Microbiology

一、菌种的衰退与复壮微生物的突变率10-10~10-5正变体（plusmutant）负变体（minusmutant）Microbiology

1.衰退的定义

衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。微生物细胞群

量变微生物细胞群

质变菌种的衰退逐步演化过程Microbiology

菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化，这种变异也称负变（minusmutation）。Microbiology

2.衰退的具体表现①原有形态性状变得不典型了；②生长速度变慢，产生的孢子变少；③代谢产物生产能力下降，即出现负变；④致病菌对宿主侵染力的下降；⑤对外界不良条件的抵抗能力下降。Microbiology

3.衰退的原因造成菌种退化的主要原因是基因突变。误区生产工艺条件控制不当杂菌污染造成生产性能

下降饰变Microbiology

（一）衰退的防止（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株（2）控制传代次数（3）创造良好的培养条件（4）利用不易衰退的细胞传代（5）采用有效的菌株保藏方法Microbiology

（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化，防止分离回复。诱变处理Microbiology

（2）控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降到最低限度，减少自发突变几率。Microbiology

（3）创造良好的培养条件创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可降低回复突变频率。Microbiology

（4）利用不易衰退的细胞传代放线菌和霉菌一般用单核的孢子接种，菌丝细胞常含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的，用于接种就易出现离异（dissociation）或。

例如衰退，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化，用子囊孢子接种不易退化。Microbiology

（5）采用有效的菌株保藏方法菌种保藏的温度、所用的培养等可影响自发突变。

菌种保藏的重要性Microbiology

（二）菌种的复壮（rejuvenation）狭义的复壮：广义的复壮：一种消极的措施一种积极的措施Microbiology

狭义的复壮：是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标、从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体、以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。是一种消极的措施Microbiology

长久保存的菌种在启用时，要经移种至适宜的培养基上进行培养，待生长后再行接种，如此连续2-3次，甚至多次，直至出现典型的形态和生活特征为止。Microbiology

广义的复壮：在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作；以期从中选择到自发的正交个体。是一项积极的措施Microbiology

复壮的方法：1.纯种分离法（purecultureisolation）2.通过宿主复壮3.淘汰已衰退的个体Microbiology

1.纯种分离法（purecultureisolation）通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就可恢复正常。

通过纯种分离把正变细胞分离出来，扩大培养，就可提高产量。Microbiology

纯种分离的方法“菌落纯”水平（purecultureincolonylever）

“菌株纯”水平（purecultureinstrainlever）粗放精细平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用“分离小室”进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离菌落纯（菌种纯）细胞纯（菌株纯）纯种分离法激光镊子技术Microbiology

（1）平板表面涂布法将适量待分离菌悬液加到平板上，用涂棒涂布均匀，培养。单菌落达到分离目的。Microbiology

（2）平板划线分离法

接种环沾取少许待分离菌种，在平板表面进行连续划线，细胞数量将随着划线次数的增加而减少，逐步分散，经培养后，得到单菌落。Microbiology

平板划线分离单菌落Microbiology

（3）用显微操纵器进行单细胞分离在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。Microbiology

Microbiology

（4）激光镊子技术

激光能捕获微小粒子，因此在它移动时就会像镊子一样，“夹”着微小粒子移动。科学家把这种现象称为“激光镊子”。

现在生物学家已能用激光镊子夹住单个细胞。

例如，从血液中分离出单个血红细胞用于研究。Microbiology

2.通过宿主复壮针对病原菌衰退的病原菌相应的昆虫或动、植物宿主体内从典型的病灶部分分离到恢复毒力的复壮菌株多次选择接种活的“选择性培养基”Microbiology

3.淘汰已衰退的个体细黄链霉菌（S.microflavus）

“5406”农用抗生菌的分生孢子，采用-10℃~-30℃的低温处理5~7d，退化的个体死亡，留下10~20%个体是为退化的，从而达到复壮的效果。Microbiology

二、菌种的保藏菌种（culture,stockculture）是一种极其重要和珍贵的生物资源！菌种保藏（preservation,conservation,naintenance）是一项十分重要的基础工作。Microbiology

国家设立专门的菌种保藏机构任务：广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株（有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等），并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱，便于研究、交换和使用。Microbiology

1.菌种保藏的原理（1）挑选典型菌种的优良纯种，

最好用芽孢或孢子等休眠体。（2）创造一个有利于长期休眠的环境条件，

干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等。（3）添加保护剂或酸度中和剂，

避免保藏过程中细胞受伤。Microbiology

干燥和低温时菌种保藏中的最重要因素（1）较低的温度更有利于保藏

液氮（-195℃）＞

低温冰箱（-70℃）＞

普通冰箱冷冻（-20℃）＞

普通冰箱冷藏（4℃）Microbiology

（2）水分在低温下形成冰晶，破坏细胞结构加入保护剂：0.5mol/L左右的甘油或二甲亚砜；海藻糖、脱脂牛奶、血清白蛋白、糊精或聚乙烯比咯烷酮（PVP）等。Microbiology

（3）介质减少冷冻对细胞损伤的机制作用机理：0.5mol/L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水左右而保护细胞；

作用机理：大分子物质如海藻糖、脱脂牛奶、血清白蛋白、糊精或聚乙烯比咯烷酮虽不透入细胞，但可通过与细胞结合的方式而防止细胞膜受冻伤。Microbiology

2.菌种保藏的方法一种良好的菌种保藏方法保持原菌的优良性状长期稳定方法的通用性操作的简便性设备的普及性Microbiology

Microbiology

常见菌种保藏方法（1）定期移植保藏法（2）液体石蜡保藏法（3）甘油悬液保藏法（4）砂土保藏法（5）冷冻干燥保藏法（6）液氮保藏法Microbiology

（1）定期移植保藏法操作方法：①将菌种接种在液体、斜面或穿刺在半固体培养基上②生长完全③放置密封盒中，普通冰箱4℃保藏，

相对湿度50%~70%以下；或培养物用无菌脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液加入菌种瓶中，-80℃保藏。Microbiology

保种机制：（1）低温可减缓生长速度，（2）通气不良，（3）有限的营养。保藏时间：一般4~6个月必须传代一次保藏种类：各大类微生物Microbiology

定期移植保藏法优点：操作简便，不受条件限制，各类生物均可。缺点：时间段，传代多，易退化。Microbiology

（2）液体石蜡保藏法操作方法：①将菌种接种斜面培养基上，②生长完全后，在斜面上覆盖无菌的液体石蜡，液面高于斜面1cm，③放于普通冰箱4℃保藏。Microbiology

保种机制：（1）石蜡可防止培养基水分蒸发，（2）石蜡可隔氧，（3）低温可减缓生长速度，（4）通气不良（5）有限的营养。保藏时间：1~2年保藏种类：除石蜡发酵微生物外，各大类微生物均可Microbiology

液体石蜡保藏法优点：操作简便，不受条件限制，各类生物均可。缺点：时间段，传代多，易退化、不能保存石蜡微生物。注意：石蜡的纯度

致病菌Microbiology

（3）砂土保藏法操作方法：①将砂和土用酸浸泡去除其中的有机质，②洗涤中和，干燥，③分装于安瓶内、加塞灭菌，④把健壮的孢子悬液滴于砂土中搅拌均匀，⑤真空干燥后封口，⑥置于干燥器或4℃冰箱中保存。Microbiology

保种机制：（1）砂土营养贫乏，（2）真空干燥去除水分和氧，（3）低温可减缓生长速度，（4）通气不良保藏时间：1~10年保藏种类：产孢子的微生物Microbiology

砂土保藏法优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，时间可达几年至数十年。缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营养细胞。Microbiology

（4）冷冻干燥保藏法将液体样品（含保护剂的菌态液）在冻结状态下升华其中的水分，最后达到干燥。

培养物用无菌脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷冻、抽真空、封口。Microbiology

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冷冻干燥保藏法优点：低温、干燥、无氧、无营养，有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。缺点：不能保藏真菌菌丝。Microbiology

（5）液氮保藏法操作方法：液氮温度可达-196℃，把菌悬液密封于安瓶中，置液氮罐内保藏。Microbiology

液氮保藏法优点：保藏效果好。缺点：价格昂贵。Microbiology

（6）基因工程菌保藏携带外源基因的重组质粒通常是不稳定的，容易丢失，一般情况下，细胞丢失了质粒，生长会加快。基因工程的保藏是利用在抗性培养基中只有含重组质粒的细胞才能生长的原理设计的。Microbiology

例如，质粒pBR322中含有Ampr和Tetr，外源DNA插入到Tetr，重组质粒转化入E.coli中，在培养基中加入Ampicillin（氨苄青霉素）选出重组质粒细胞Ampicillin+Tetracyclin（四环素），即可选出含有质粒pBR322的细胞。Microbiology

不同的微生物需要不同的保藏方法。

没有一种保藏方法能适宜所有的微生物。

选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特

性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综

合考虑。

重要的菌株，要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌株的丧失。Microbiology

不同保藏方法比较Microbiology

三、菌种保藏机构（一）国内1978年7月，中国微生物菌中保藏管理委员会（CCCCM）在北京成立。Microbiology

下设六个全国性菌种保藏管理中心1.普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC中科院微生物研究所(AS)：细菌、真菌中科院武汉病毒研究所(AS-IV)：病毒2.农业微生物菌种保藏管理中心ACCC中国农科院3.工业微生物菌种保藏管理中心CICC轻工部食品发酵工业科学研究所(IFFI)Microbiology

4.医学微生物菌种保藏管理中心CMCC卫生部药品生物检定所(ID)：细菌中国医学科学院皮肤病研究所(NICPBP)：真菌中国医学科学院病毒研究所：病毒5.抗生素菌种