DB2102-T 0083-2023 小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程

65.150CCS

B

51DB2102 2102/T

0083—2023小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程Code

of

practice

purification

of

closterium 大连市市场监督管理局 发

布DB2102/T

—2023 本文件按照

1.1-2020《标准化工作导则

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由大连市农业农村局提出。本文件由大连市海洋发展局归口。本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院本文件主要起草人：刘卫东、刘忠颖、鲍相渤、李云峰、李玉龙。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可通过来电、来函等方式进行反馈，有关单位将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归

口

管

理

部

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地

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：

大

连

市海

洋

发展

局

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大

连

市

西

岗

区

长春

路

号

）

，

联

系

电

话文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁5013384111868。DB2102/T

—20231范围本文件规定了水产养殖用小新月菱形藻

藻种（以下简称藻种）提纯复壮的术语存、细胞提纯复壮及扩繁等内容。本文件适用于水产养殖用小新月菱形藻等低温硅藻的一级藻种提纯复壮。2 规范性引用文件文件。GB

11607-1989渔业水质标准SC/T

2047-2006 水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范DB21/T

2777-2017 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1藻种细胞提纯复壮 purification

of

algae

cells恢复原藻种的典型性状。3.2固体培养基 solid

保存培养的培养基。3.3藻种克隆 algae

由同一个藻种细胞分裂繁殖而形成的、具有相同遗传物质的细胞系。DB2102/T

—20234 水质和设施设备条件4.1 水质条件所用海水应经沉淀、过滤处理，水质应符合GB

11607-1989的规定。4.2 设施设备4.2.1 清洗设备水槽、试管刷和大瓶刷。4.2.2 消毒设备紫外灯、烘箱、高压灭菌锅、电陶炉、煤气或液化气灶具。4.2.3 操作观察设备μ

l和1

移液器及配套枪头，用于培养的一次性无菌培养皿（直径90

mm～

）和

～40

玻璃试管（配有带砂芯乳胶塞），试管架、20

一次性无菌注射器及0.22μ

m孔径无菌针筒式滤膜过滤器。4.2.4 培养保种设备光照培养架、低温展示柜、恒温光照培养箱。5 藻种培养液和固体培养基的配制5.1营养液配制5.1.1 康威培养基（以下简称

A

液）、康威培养基—微量元素溶液（以下简称

B

液）和康威培养基—硅酸钠溶液的成分参照

A，康威营养液由

A

B

液组成，具体如下：a)配制

A

液时，将

DB21/T

2777-2017

表

A.1.1

中试剂加入纯水中，加热至试剂完全溶解；b)配制

B

液时，将

DB21/T

2777-2017

表

A.1.2

中试剂加入纯水中，滴加

10%盐酸摇匀，至试剂完全溶解，液体澄清；c) 将

B

A

液中，放置

h

以上，即成为康威营养液。5.1.2 藻种培养用尿素溶液配方见附录

A。5.2固体培养基用抗生素溶液配制藻种固体培养基用抗生素溶液配方见附录B。5.3 藻种扩繁用培养液配制灭菌海水冷却后，按照：1体积比分别加入灭菌的康威营养液、康威培养基—硅酸钠溶液和尿素溶液后摇匀。5.4 固体培养基配制向

ml海水中加入0.8

g～1

g琼脂粉，加热至溶解制成琼脂海水基质，高压灭菌后置超净工作台中，于室温下冷却至45℃～55℃时按照1000：1体积比分别添加灭菌的康威营养液、康威培养基—硅酸DB2102/T

—2023钠溶液、尿素溶液和抗生素溶液后摇匀，立即向一次性灭菌培养皿内倒入约

ml，使培养基铺满每个培养皿底部，静止放置至培养基凝固后，倒置于超净台中备用。6 消毒除菌6.1 藻种扩繁用海水灭菌按照SC/T

2047-2006中规定的微藻分离、保存用海水的消毒方法执行。6.2 营养液和固体培养基灭菌康威营养液、康威培养基—硅酸钠溶液以及琼脂粉海水基质应采用121

℃高压蒸汽灭菌15

素溶液应采用0.22μ

m孔径无菌针筒式滤膜过滤器过滤除菌。6.3 器具灭菌塑料器具应采用121℃高压蒸汽灭菌15

min3

h灭菌。7 固体培养上藻种培养与保存7.1 接种7.1.1 藻种活化藻种（细胞浓度为8×106

cell/ml～×107

）按照1：1000比例接种藻种扩繁用培养液，环境温度17℃～20℃，光照度3000

～6000

Lux下培养2

d。7.1.2 藻种的接种用微量移液器向固体培养基上添加μ

Lμ

L～20

μ

L放入固体培养基中，使灭菌海水与藻种混合。向固体培养基上加入46颗直径4

培养基上随机滚动，将藻种和海水均匀涂布在固体培养基上。2

h～4

h后，固体培养基上液体被基本吸收后，用封口膜缠绕培养皿侧面，将培养皿上下结合部空间封闭。7.2 藻种克隆的培养适宜条件下（见7.1.1）培养固体培养基上的藻种细胞，

d～

d后，在固体培养基上长出1

以上的藻种克隆。7.3 藻种克隆的度夏保种当固体培养基上长出大于1

mm存期可达5个月～17个月。8 细胞提纯复壮及扩繁DB2102/T

—20238.1 固体培养基上藻种细胞的提纯复壮秋季，室温下降至20℃时，对固体培养基上藻种细胞进行提纯复壮筛选：没有细菌混杂的藻种克隆；

10

7.1.1）培养，同时进行多个藻种克隆的筛选培养，一个藻种克隆培养一管，不同藻种克隆间不应相互混淆。8.2 提纯复壮藻种的扩繁当试管内的藻细胞生长密度超过3×106

400

ml扩繁营养液的

ml三角烧瓶中,

7.1.13.0

100

DB2102/T

—2023AA附

录 A（资料性）藻种培养用尿素溶液配方A.1藻种培养用尿素溶液配方见表表表

A.1 藻种培养用尿素溶液配方100

100

100

DB2102/T

—2023BB附

录B（资料性）藻种固体培养基用抗生素溶液配方B.1藻种固体培养基