药物杂质研究方法的建立与应用

药物杂质研究方法的建立与应用

山东省药品检验所

牛冲

2010年10月25日济南一杂质研究概述

二杂质定义、分类、来源

三杂质研究主要内容

四杂质限度的确定一杂质研究概述杂质研究是药品研发的一项重要内容，贯穿于药品研发的整个过程，与工艺研究、质量研究、稳定性研究、药理毒理及临床研究间存在着密切关系，直接关系到上市药品的质量及安全性。它包括选择合适的分析方法、准确的分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。毒性杂质—安全性普通杂质，控制纯度—有效性杂质产生的原因—优化工艺BP80：提出有关物质（relatedsubstance）概念BP98：首次收载有关物质及残留溶剂检查通则增加了杂质研究指导原则各论项下增加已知杂质限度，并提供杂质名称，分子式，分子结构。

纯度控制杂质控制杂质谱控制我国杂质研究现状研究基础薄弱杂质来源不清

杂质种类，数量，来源，产生或引入过程以及降解途径杂质检查方法缺乏针对性制定的限度依据不充分，未结合杂质研究指导原则要求及实测结果制定单个杂质的限度。国内有关物质限度多采用自身对照法，仅限定单个杂质和总杂质。这种方法尽管对相对控制药品的质量起到了积极的作用，但与ICH的要求还有差距，并且对于控制复方制剂中的有关物质则可能存在很大的风险。杂质检查结果难于评价

未与原发厂药品进行杂质种类和含量的比较研究与分析实例1奥沙利铂

奥沙利铂属于第三代铂类抗肿瘤药,由赛诺菲-安万特公司研发。

1996年4月，法国批准奥沙利铂作为转移性结直肠癌二线治疗药，1998年4月作为一线治疗药。美国FDA于2004年批准奥沙利铂注射液与氟尿嘧啶/叶酸一起输注联合用药治疗晚期结肠癌或直肠癌。奥沙利铂国家标准奥沙利铂WS1-(X-104)-2003Z注射用奥沙利铂WS1-(X-090)-2003Z奥沙利铂甘露醇注射液YBH38062005有关物质甲醇-水=10：90甲醇-水=10：90甲醇-水=7：93检测波长250nm检测波长250nm检测波长249nm杂质总和不得过1.0%杂质总和不得过1.0%杂质总和不得过1.0%左旋异构体甲醇-乙醇=7：3无甲醇-乙醇=7：3检测波长250nm检测波长250nm不得过0.5%不得过0.5%Ag无无无EP6.0流动相检测波长限度杂质A乙腈：溶液（10ml320g/L四丁基氢氧化铵溶液，加1.36g磷酸二氢钾，用水稀释至1000ml，用磷酸调pH至6.0）=20：80。205nm0.1%杂质B乙腈：溶液（1.36g磷酸二氢钾和1g庚烷磺酸钠溶解与1000ml水中，用磷酸调pH至3.0±0.05）=20：80215nm0.1%杂质C溶液：乙腈（取0.6ml稀磷酸溶液，用水稀释至1000ml，用氢氧化钠溶液或磷酸调pH至3.0±0.05）=99：1210nm0.1%单一杂质0.1%其他杂质总和0.1%杂质总和0.3%异构体乙醇：甲醇=3：7（V/V）254nm0.1%Ag原子吸收5ppm样品杂质A杂质C其他杂质个数EPChPEPChPEPChP1检出/检出/5/2检出/检出/313检出/检出检出314检出/检出/515检出/检出检出616检出/检出检出617检出/检出检出31关于注射用奥沙利铂有关物质检查方法的探讨傅萍,兰婉玲,张蕾；药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29(11)问题：简单地套用含量测定的色谱条件，将主药的最大吸收波长确定为检测波长，造成对杂质含量的低估甚至漏检，不能反映产品的真实质量。二杂质定义、分类2.1杂质的定义任何影响药品纯度的物质药品杂质分析指导原则药物中存在的化学结构与该药物不一致的任何成分。

ICHQ3A（R1)1)有毒副作用的物质2)

本身无毒副作用，但影响药物的稳定性和疗效的物质3)

本身无毒副作用，也不影响药物的稳定性和疗效，但影响药物的科学管理的物质质量标准中的杂质按照国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺或原料带入的杂质，或在贮存过程中产生的杂质。不包括：1）变更生产工艺和原辅料2）掺入或污染的外来物质理化性质：有机杂质、无机杂质、残留溶剂。来源：工艺杂质、降解产物、其他杂质和外来物质等。按毒性：毒性杂质和普通杂质等。按结构：几何异构体、光学异构体、其他甾体、其他生物碱等。2.2杂质分类三杂质研究的主要内容

原则：结合在研产品具体的工艺以及产品的特点开展研究。格列美脲（国家药品标准WS1-(X-054)-2004Z）有关物质：杂质1:4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-1-甲酰胺基]乙基]苯磺酰胺甲酸乙酯杂质2:4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-1-甲酰胺基]乙基]苯磺酰胺。BP2008及USP31均未考察杂质1，而是……甲酸甲酯，经检索，该杂质与合成工艺有关，国内合成中间体为……甲酸乙酯,故杂质1设置合理。杂质谱分析结合生产工艺及产品特点分析产品中可能产生的杂质，对产品中杂质的来源及结构情况有较为全面的了解建立合适的分析方法在杂质谱分析的基础上，有针对性地选择合适的分析方法，并对方法进行验证。制定合理的限度综合药学、药理毒理及临床研究结果确定合理的杂质限度，保证药品的质量及安全性。3.1杂质谱的分析

ImpurityProfile（杂质谱）:

Adescriptionoftheidentifiedandunidentifiedimpuritiespresentinadrugsubstance.

对存在于药品中所有已知杂质和未知杂质的总的描述。A原料杂质谱分析（1）分析起始原料引入的杂质实例1：氟尿嘧啶系氟胞嘧啶合成的起始原料或中间体

中国药典（2010）采用HPLC法对氟尿嘧啶进行控制实例2奥沙利铂的合成中，草酸作为反应物EP6.0和BP2009均对其进行了控制。（2）反应过程中产生的副产物实例3奥沙利铂合成过程中产生的杂质

分析药物中的不稳定基团和活泼基团,

初步推测药物的降解途径和降解产物。不稳定结构:

酯键(包括内酯)

酰胺键(包括内酰胺)

季铵键活泼基团:

酚羟基噻吩基吡啶基醛基（3）

降解产物

依那普利的结构中含有羧酸乙酯基，该基团易发生水解反应，生成羧基，即产生依那普利拉。依那普利的结构中含有羧基，同时还含有氨基，它们易发生酰化反应生成内酰胺结构，即产生依那普利二酮哌嗪。实例4依那普利降解产物B制剂中杂质谱分析原料引入的杂质

除降解产物及毒性杂质外，原料药中控制的杂质，制剂中一般不再控制。制剂制备过程产生的杂质考察制剂制备前后杂质情况的变化原辅料配伍作用产生的杂质

原料与辅料复方制剂各组分制剂贮藏条件下降解产物

稳定性考察（加速/长期试验）实例6盐酸艾司洛尔注射液

本品化合物结构主要为苯丙酸甲酯，酯类药物易水解，其在水溶液中不稳定，理论分析降解产物为苯丙酸和甲醇等。

实例7乳糖乳糖的结构中含有半缩醛羟基，它可以转化成醛式，这一结构特征可与含有伯胺类结构的化合物如苯胺类、氨基酸等发生缩和反应，生成腙与糖脎等衍生物，可见，乳糖与含有伯胺类结构的药物存在着配伍禁忌。对于缺乏相关研究资料的情况，可以考虑进行主药与辅料/包材之间的相容性试验，例如，口服固体制剂，可以将主药和辅料按一定比例混合后，进行影响因素试验。

实例8奥沙利铂甘露醇注射液杂质A杂质B杂质C实例9复方阿司匹林片C仿制药杂质谱的分析

对拟仿药品质量标准进行分析部分品种的国家标准的中有已知杂质检查收入EP、BP、USP的品种，通过其质量标准，可得到更多的已知杂质信息杂质谱与拟仿品一致或杂质种类较拟仿品少，各杂质含量不超过拟仿品

试制品的杂质控制达到了研究目标杂质谱与拟仿品一致或杂质种类较拟仿品少，但杂质含量超过拟仿品

改进工艺，降低杂质含量杂质谱与拟仿品不一致，有超过鉴定限度的新杂质；已知杂质含量超过拟仿品

鉴定新杂质结构，分析产生新杂质的原因，改进工艺，降低杂质含量至鉴定限度以下有明确安全性数据的杂质，应降低其含量至安全范围，并在质量标准中进行控制。超过质控限度的未知安全性杂质，应提供其安全性论证资料。3.2分析方法的选择选择依据：待测药品及杂质的理化性质、化学结构、杂质的控制要求目标：专属、灵敏、准确、简捷。分析方法各有局限，注意不同原理分析方法间的相互补充和验证。

A有机杂质分析方法化学法、光谱法、色谱法质量标准中普遍采用的方法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法(TLC)气相色谱法(GC)毛细管电泳法（CE）由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证HPLC与TLCHPLC与CE反相HPLC系统与正相HPLC系统HPLC不同检测器单一方法不能满足多个杂质的检测时，可采用两种或两种以上的方法互为补充，控制杂质。HPLC法：专属、灵敏、准确、简捷外标法（杂质对照品法）

定量准确，需杂质对照品加校正因子的主成分自身对照法对校正因子进行严格测定，仅适用于已知杂质的控制不加校正因子的主成分自身对照法前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同，有一定误差峰面积归一化法

因各杂质与主成分响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素，可产生较大误差。理想的定量方法：已知杂质对照品法+未知杂质不加校正因子的主成分自身对照法已知杂质对主成分的相对响应因子在0.9-1.1范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量；超出0.9-1.1范围时，宜用杂质对照品法计算含量，也可用加校正因子的主成分自身对照法。TLC法杂质对照品法主成份自身对照法

杂质斑点颜色与主成份斑点颜色一致的情况对于无机杂质，各国药典都收载了经典、简便而又行之有效的检测方法。对于成熟生产工艺的仿制，采用药典收载的方法进行质量考察及控制。对于采用新生产工艺生产的新药，鼓励采用离子色谱法及电感耦合等离子发射光谱－质谱（ICP-MS）等分析技术B无机杂质的分析方法不挥发性无机杂质----------炽灼残渣药典尚未收载的无机杂质（如磷酸盐、亚磷酸盐、铝离子、铬离子等）的检测，可根据其理化特性，采用离子色谱法、原子吸收分光光度法、比色法等检测某些金属阳离子杂质（银、铅、汞、铜、镉、铋、锑、锡、砷、锌、钴与镍等）---------重金属对某种（些）特定金属离子或上述方法不能检测到的金属离子作限度要求，可采用专属性较强的原子吸收分光光度法或经典比色法（如药典已收载的铁盐、铵盐、硒等的检查法）砷盐检测法硫酸根离子、氯离子、硫离子3.3分析方法的验证3.3.1波长的选择对产品中可能存在的杂质的紫外吸收特性进行研究。

DAD检测器根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。对不同杂质难于找到适宜的检测波长：

可选择在不同波长下分别测定采用加校正因子的主成分自身对照法常见问题简单套用含量测定项下色谱条件，以主要的最大吸收波长作为有关物质检测波长。杂质在此波长下的吸收可能偏低，甚至无吸收，造成杂质含量的低估甚至漏检。关于注射用奥沙利铂有关物质检查方法的探讨傅萍,兰婉玲,张蕾；药物分析杂志，2009,29(11)3.3.2溶剂的选择常用溶剂为甲醇，乙腈截止波长甲醇：205nm乙腈：190nm3.3.3洗脱方式

等度洗脱梯度洗脱：

杂质研究中值得借鉴的手段，有效检出极性相差悬殊的系列杂质。辛伐他汀-------等度洗脱新药转正标准34册WS1-(X-064)-2003Z色谱柱：AgilentExtendC18色谱柱，柱温：35℃，流速：1.0ml/min流动相：乙腈-0.025mol/L磷酸二氢钠溶液（pH4.5）=65：35检测波长：238nm，辛伐他汀------梯度洗脱中国药典2010年版二部色谱柱：lunaC18（3μm,33*4.60mm）流速：3ml/min检测波长：238nm流动相：A：乙腈-0.1%磷酸溶液（50：50）

B：含0.1%磷酸的乙腈梯度洗脱时间流动相A（%）流动相B（%）010004.510004.69558.0257511.5257511.610001310003.3.4验证项目中国药典2010二部附录ⅪⅩA药品质量标准分析方法验证指导原则A专属性专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。溶剂干扰，制剂要考虑辅料干扰反应的中间体、立体异构体、粗品、重结晶母液等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求强制降解试验考察方法能否有效检测出原料药或制剂中的降解产物。酸降解:0.1－1mol/LHCl溶液碱降解:0.1－1mol/LNaOH溶液氧化降解:合适浓度的H2O2溶液必要时可以加热或提高浓度高温试验:通常温度高于加速试验温度的10℃，如50℃、60℃等对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解；考虑在不同的pH值条件下的降解光照试验:可采用4500LX强制降解试验原料药杂质研究中，忽视了合成中间体、粗品在方法专属性验证中的作用。合成中间体、杂质残存是原料药杂质的主要来源之一，如建立的方法不能将这类杂质分开，便不能用于产品杂质的有效控制。强制降解试验破坏条件太剧烈主药峰太低，甚至消失，无法观察其分离情况（破坏10%左右）。关注10%50%强制降解试验峰纯度可采用二极管阵列检测器、质谱检测器等检测峰的纯度。以免因分离度不符合要求，导致分析结果的不准确。如不具备检测峰纯度的试验条件，可通过适当调整流动相的组成或比例使各色谱峰的相对保留时间发生改变，用同一份经加速破坏试验的供试品溶液进样，比较流动相调整前后杂质峰的个数也可采用TLC法比较同一份经加速破坏试验的供试品溶液在不同展开系统下的斑点个数及位置。遗漏了药品敏感条件的破坏试验

如在影响因素稳定性试验中表明某药品易光解，但在破坏性试验中却未考察主峰与光解产物的分离情况。B灵敏度检测限及定量限检测限：被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。（S/N=3：1）

该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此对杂质限度试验，需证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。

定量限：被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。（S/N=10：1）体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。C精密度

在规定的测试条件下，同一个均匀样品经多次取样测定所得结果之间的接近程度重复性在相同条件下由同一分析人员测定所得结果的精密度中间精密度在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度D准确度测定结果与真实值或参考值接近程度已知杂质：回收率未知杂质：与另一成熟方法比对如药典方法或经过验证的方法比对E线性

在设计范围内，检测响应值与待测物质量之间成正比例关系的程度。F范围

检测方法能达到一定精密度、准确度和线性的高、低浓度或量的区间范围应在规定限度的±20%间或定量限至限度的+20%间，若含量测定和杂质检查同用一套色谱系统，则线性范围应为杂质限度的-20%至含量限度（上限）的+20%间G耐用性耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明。HPLC：流动相的组成比例及pH值、不同厂家或批号的色谱柱、柱效、柱温、流速TLC：适当改变展开剂比例及pH值GC：载气及流速、不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、担体、柱温、进样口和检测器温度等。待测物质与已知杂质，待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其它难分离物质），采用适当方法（如主成分降解破坏）制备系统适用性试验溶液

关注1：杂质分析时应格外关注分离度，并应在“色谱条件与系统适用性试验”项下对其作出具体规定。已知杂质或辅料与主成份的分离度，不宜将同等浓度的杂质与主成分混合，应参照限度，一般将1%浓度量的杂质加到100%浓度的主成分中，比较客观科学地反映样品中可能存在的杂质实际情况。咖啡因关注2溶液浓度的确定供试品溶液浓度的确定是杂质检查中的一个重点浓度越高，越能反映样品中杂质的存在情况。问题：若设定过高，超载现象若设定过低，达不到检测目的，观察不到杂质量的变化。对策：从最低检测限入手，采用“上推法”来确定。

最低检测限→对照溶液→供试品溶液

20~50倍200~5000倍四杂质限度的确定完全除去杂质是不可能的也没有必要，将杂质控制在安全合理的范围内，这个允许的范围极为杂质限度

基本原则：在可行的范围内尽可能低报告限度（ReportingThreshold）：超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据。鉴定限度（IdentificationThreshold）：超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构。质控限度（QualificationThreshold）：质量标准中一般允许的杂质限度，如制订的限度高于此限度，则应有充分的依据。ICHQ3A（R）；ICHQ3B（R）；化学药物杂质研究的技术指导原则原料药杂质限度最大日剂量报告限度鉴定限度质控限度≤2g0.05