超详细的真菌检验学习笔记

超详细的真菌检验学习笔记

01

何为真菌？

基本特征

①真核细胞型微生物，属于真菌界；

②具有典型细胞核，有完整的细胞器，不含叶绿素，不分

根、茎、叶；

③单核细胞或多核细胞组成的；

④细胞壁含几丁质和葡聚糖；

④以寄生或腐生的方式生存，能进行有性生殖或(和)无

性生殖

⑤致病性：引起人类感染性、中毒性、变态反应性疾病。

真菌的分类

(1)分类单位：

(2)按形态分：

①单细胞真菌：

酵母菌：如新生隐球菌，以出芽方式繁殖，不形成真假菌

丝；

酵母样菌：如念珠菌属，以出芽形成芽管，形成假菌丝。

②多细胞真菌：

由菌丝+泡子组成丝状菌（霉菌）形成菌落为丝状型，

如：曲霉、毛霉、青霉、皮肤癣菌等、各种霉菌的菌丝和泡子

形态不同，是鉴别真菌的重要标志。

「菌丝」：呈管状，长度随不同的生长条件而异，是由成

熟抱子以出芽方式繁殖时形成的。在适宜的环境中由泡子长出

芽管，并长出分支而不断生长形成的或有一段菌丝细胞增长而

形成，许多菌丝交织成团，成为菌丝体。

A.按形态不同：

螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳妆、关节状菌丝

等。

B.按结构不同：

有隔菌丝：是由横隔将管状结构的菌丝分隔成一连串多细

胞样的丝状体如霉菌、青霉和毛癣菌菌丝（大多致病菌为有隔

菌丝）。

无隔菌丝：无隔膜整条菌丝为单个细胞，细胞质内有多个

细胞核，根霉和毛霉的菌丝。

C.根据菌丝生长方式（功能）不同分：

营养菌丝：伸入到培养基内的菌丝。

气生菌丝：露出培养基表面、向空间生长。

生殖菌丝：气中菌丝可生产有性或无性匏子。

菌丝的结构和组成是真菌形态的的一个重要的特征，这有

助于对真菌的鉴别。

「袍子」：是真菌的繁殖体，不同的真菌都有其特定的苑

子，其形态、大小表面纹饰和色泽等各不相同。

根据繁殖的方式分为两种：

A.有性泡子：是经过两性细胞接合的繁殖方式，通常经过

质配、核配和减数分裂三个过程。如：泡子菌丝、皮炎芽生

菌、石膏样小抱子菌等。

B.无性抱子（多为病原性真菌繁殖方式）

无性苑子按形态不同分：

①分生电子：真菌中最常见的一种。

大分生袍子：（多细胞性）其大小、细胞数和颜色是鉴定

真菌的重要依据。

体积较大，分隔成较多细胞，长呈梭形，棍棒型，梨形

小分生抱子：（单细胞性）各种真菌都能产生小分生泡

子，鉴别意义不大。

体积小，单细胞性外壁薄，有球型，卵形，梨形以棍棒状

等各种不同的形态及。

②叶状抱子：菌丝内细胞直接形成。

芽生电子：由细胞出芽生成，多数芽生匏子生长到一定大

小即与母体脱离，若不脱离，形成菌丝状，被称为假菌丝。

关节抱子：菌丝生长到一定阶段后，出现很多横膈膜，然

后从横隔膜处断裂形成矩形、筒形或短柱状的袍子。多出现与

陈旧的培养物中。

厚膜袍子：菌丝或分支的顶端有少数细胞有菌丝内胞质浓

缩、薄壁增厚形成，是为了抵抗不良环境，真菌的一种休眠

体。环境适宜时又可出芽繁殖。

③泡子囊泡子：菌丝分支的顶端或泡囊梗膨大形成泡子

囊，内含许多泡子，泡子成熟后则破囊而出。如毛霉、根霉等

形成的匏子囊泡子。

02

真菌检验的基本技术

1.标本直接镜检

•生理盐水

•透明胶带法

2.染色镜检法

•革兰染色（为革兰阳性，为深紫红色）

•墨汁染色法

•乳酸盼棉蓝染色法

•荧光染色

・糖原染色（PAS）：真菌及组织内的多糖多糖-红色；核-

蓝色；背景-淡绿色。

,银染色法

•吉姆萨染色、瑞氏一吉姆萨染色法

•病理组织染色法

3.真菌培养及鉴定

（1）培养方法

•点植法

•划线法

・直接培养与间接培养

•试管培养

・平板培养

•大培养

・小培养：玻片法、方块法、小钢圈法

(2)培养条件

・pH一般在5.0-7.0(大部分真菌适应中性或偏酸环

境)；

•温度：多25-28P,深部真菌一般37C；二相真菌26C

左右，为菌丝相，37℃,酵母相。

•渗透压

(3)常用真菌培养基

4.培养真菌的菌落形态：

①酵母型菌落：(类似一般细菌菌落)菌落光滑、湿润、柔

软、致密，似酵母。为单细胞真菌的菌落，以出芽方式繁殖，如

新型隐球菌显微镜检可见圆形或椭圆形生芽细胞。

②类酵母型：外观性状同酵母型菌落，但除有生芽细胞外，

还有假菌丝伸入培养基中，是由伸长的芽生袍子形成如白念珠

菌。

③丝状菌落：菌丝疏松，呈棉絮状、绒毛状或粉末状等，一

部分菌落向上生长并形成泡子，一部分深入培养基下层。菌丝正

面和背面可显示各种不同的颜色，常作为鉴定菌种的参考。

6.临床标本的真菌学检查

(1)根据标本类型分为：

①血液标本

②骨髓标本

③中心静脉导管标本

④脑脊液标本

⑤痰、肺泡灌洗液、保护毛刷标本

⑥分泌物标本

⑦尿液标本

⑧粪便标本

(2)根据侵袭部位分：

皮肤黏膜感染性真菌：

①皮肤癣真菌

毛癣菌属

表皮菌属：只有絮状表皮癣菌致病

小泡子菌属

②表面感染真菌

③皮下组织感染真菌：引起头癣、足癣、股癣、甲癣、体癣

引起侵袭性感染性真菌：

①酵母型真菌：念珠菌属、隐球菌属

②丝状真菌：曲霉、毛霉、镰刀菌属

③卡氏肺泡菌

④二相性真菌：组织胞浆菌、马尔尼菲青霉、粗球疱子菌、

副球电子菌

「二相性真菌」：

二相性：有些真菌可因营养、温度、颜色等环境的改变，

二两种形态发生互变。

二相性真菌：在体内或体外含动物蛋白的培养基上37T培

养为酵母型真菌；在体外普通培养基上25T培养为霉菌型真

菌，如球匏子菌、组织胞浆菌、芽生菌和匏子丝菌、副球匏子

菌。

画

实验室常见真菌

念珠菌属

1.分类

念珠菌属(Candida)(假丝酵母菌属)生物学上属于半知菌

亚门，该属菌有150多个种，常见致病的有11种。

白念珠菌(Candidaalbicans)(白假丝酵母菌)为最常见的

致病菌。

白念珠菌(C.albicans)

热带念珠菌(C.tropicalis)

克柔念珠菌(C.krusei)

光滑念珠菌(C.glabrata)

季也蒙念珠菌(C.guilliermondi)

维斯念珠菌(C.viswanathii)

近平滑念珠菌(C.parapsilosis)

都柏林念珠菌(C.dublinniensis)

星形念珠菌(C.stellatoidea)

克菲念珠菌(C.kefyr)

2.临床意义

•分布与自然界，通常存在与人的体表、口腔、上呼吸

道、肠道和阴道黏膜

•大多是人体正常菌群，感染可以是内源性的，也可是

外源性的。

•可侵袭多个部位，引起浅部和全身性感染

白念

女性的念珠性阴道炎、外阴炎；男性念珠菌龟头炎、包皮炎

体质虚弱的婴儿：鹅口疮念珠性阴道炎、外阴炎、肺炎、膀

胱炎、肾盂肾炎和心内膜炎

中枢神经系统白念珠菌病：脑膜炎、脑膜脑炎、脑脓肿等

热带

先天性免疫缺陷的致病菌，可引起皮肤、黏膜和内脏念珠菌

病

克柔

引起系统性念珠菌病，特别是先天性免疫缺陷患者和大量接

受抗菌药物治疗的患者

光滑

人体一种腐生菌，可导致泌尿生殖道感染，也是新生儿的条

件致病菌

3.生物学性状

①菌体圆形或卵圆形，革兰阳性，着色不均匀。

②以出芽繁殖，形成米色或灰色的酵母样菌落，有时表面有

褶皱。

③组织内：可见芽生泡子和假菌丝。

玉米粉培养基：假菌丝、厚膜袍子

墨汁染色：阴性--没有荚膜

4.微生物检查学

①直接镜检：一般用于浅部念珠菌的检查，也可用于血、

尿、脑脊液、活检组织等标本的检查。显微镜下观察，呈圆形或

卵圆形的芽生匏子，假菌丝和菌丝。

克柔可见假菌丝成对分枝，有细长的芽生电子；

光滑可见卵圆形芽生袍子，细胞尖端单芽，无真假菌丝不产

生厚膜泡子

②分离培养及鉴定：可接种于沙保弱、血平板等培养基。沙

保弱培养基，25℃或37T培养1-4天

白念珠菌：乳白色、奶油色、隆起、表面湿润、光滑类酵母

型菌落，镜检可见假菌丝和芽生泡子；

热带念珠菌：乳白色至奶油色、隆起、无光泽、或稍有光泽

的菌落；

克柔念珠菌：生长快，菌落大，呈柔软、乳白色至乳黄色菌

落。

光滑念珠菌：42T可生长，25或37T培养3日，形成光

滑、湿润、隆起、白色和奶油色乳酪样较小菌落。

5.念珠菌的鉴定方法

①芽管形成试验：待测菌加0.5〜1ml人或动物血清——镜

检（37℃水浴1.5-4h）

结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管

并非所有的白念珠菌都形成芽管，需要设阴（热带念珠菌）

阳（白念珠菌）性对照。培养时间不可过长，热带念珠菌在血清

中培养6h或更久也可形成芽管。

②厚膜匏子形成试验：在玉米粉琼脂上，25C-28C孵育24-

48h,念珠菌属中仅白念珠菌产生厚壁抱子。

③氯化三苯基四氮嘎反应

白念-不变色（淡红）

热带-深红色或紫色

其它一红色

④商品化显色培养基

原理：是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物

反应显色的原理。（显色底物：由产色基因和微生物部分可代谢

物质组成，在特异酶作用下，游离出的显色基因显示一定颜色，

观察颜色）

翠绿色菌落为白念珠菌，

铁蓝色菌落为热带念珠菌，

淡粉红色菌落为克柔念珠菌，

紫色菌落为光滑念珠菌

其它为白色

⑤G试验

G试验（1,3-B-D-葡聚糖）可特异性激活邕变形细胞裂解

物种的G因子，引起裂解物凝固）

G试验检测的是真菌的细胞壁成分一一1,3-B-D-葡聚糖，

人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液中含量

增高。

原理：

1,3-B-D-葡聚糖能特异性激活反应主试剂中的G因子、凝

血酶原等，引起显色基质中酰胺键的断裂，产生能在405nm下

的显色物质pNA,,引起吸光度的变化。进行定量检查。

临床意义：

适用于除隐球菌和接合菌(毛霉菌)外的所有深部真菌感染

的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。以下情

况可出现假阳性：

(1)使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其

他含有葡聚糖的材料；

(2)静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制

品；

(3)链球菌血症；

(4)操作者处理标本时存在污染。

⑥其他：抗原检测、抗体检测、核酸检测

隐球菌属

1.致病特点：一般为外源性感染，经呼吸道侵入人体，可由

肺经血传播至脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。

防最易侵犯的是中枢神经系统，引起慢性脑膜炎，出现脑膜

刺激症状。

的新生隐球菌病好发生于体质虚弱，免疫力低下者。如白血

病、艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病等病人。

b荚膜多糖是新生隐球菌重要的致病物质

2.生物学性状

口圆形的酵母型菌，外周有荚膜，折光性强。

由一般染色法不着色，难以发现。

防非致病的隐球菌在37C不生长，无荚膜

▲徐和平/摄

3.微生物检验

(1)直接检查

①墨汁负染色：

通常用于检查脑脊液等涂片中的隐球菌，是涂片中检查隐球

菌的首选方法

标本中菌体较大，呈较大的球型，菌体周围有肥厚的荚膜

②隐球菌英抗原的检测：常见有乳胶凝集法、胶体免疫金层

析法、酶联免疫吸附法等。

▲徐和平/摄

③PCR检测

(2)分离培养

菌体常见出芽现象、在沙保弱和血平板上25C和37C均可

生长。但30C生长良好，菌落奶白色至棕黄色，粘稠、不透

明、边缘完整。

(3)鉴定：

①尿素酶试验：

新型隐球菌（+）、白假丝酵母菌（-）

②糖同化及发酵试验：

新型隐球菌、浅白隐球菌等可同化纤维二糖、肌醇等，但均

不能发酵糖类。

③酚氧化酶试验：

接种左旋多巴-枸椽酸铁和咖啡酸培养基，经2-5天，新型

隐球菌呈棕黑色菌落。

曲霉菌

1.基本特征

的多数只发现了无性阶段，

防条件致病菌，最常见的是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉

斯可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统和全身性曲霉病。

防呼吸系统曲霉菌病引起支气管哮喘或肺部感染。

防全身性曲霉菌病原发病灶主要是肺，可随血播散至脑、心

肌和肾等。

膏有些曲霉菌能产生毒素引起机体食物中毒，黄曲霉毒素，

杂色霉毒素有致癌作用。

2.生物学特征：

▲徐春晖/绘

组成：分生匏子头和足细胞

分生匏子头：分生梗茎、顶囊、瓶梗

梗基、分生泡子链

壳细胞：厚壁，顶生或间生的囊状细胞

▲徐和平/供

闭囊壳：有性生殖器官，壁薄，由一层或数层多角细胞构

成

▲徐和平/摄

3.分离培养

・曲霉菌在沙保培养基上，室温及37C〜45℃均能生长

•形成绒毛状或絮状菌落

・菌落开始为白色，随着袍子的产生，不同菌种可呈现各种

不同的颜色

・多数菌种只有无性阶段，少数菌种存在有性阶段

烟曲霉

的菌落扩延，蓝绿色至烟绿色，背面无色或黄褐色，绒毛

状，37~45摄氏度生长良好。

的顶囊烧瓶状：单层瓶梗，布满顶囊表面2/3；分生泡子头

圆柱形；分生泡子梗无色或绿色、光滑，无闭囊壳。

切引起肺曲霉病

黄曲霉菌

▲徐和平/供

防菌落表面黄绿色，背面无色或微褐色，羊毛状

"顶囊近球形；单层和/或双层小梗，布满顶囊表面；分生

抱子头放射状或圆柱状。泡子梗黄绿色、粗糙

断引起肺、外耳道曲霉病，甲癣

黑曲霉菌

的生长迅速，菌落初为白色羊毛状，后为黑色或黑褐色粗绒

状，背面无色或略带黑褐色

防顶囊近球形；单层和/或双层瓶梗；分生电子头球形放射

状，褐色至黑色；泡子梗无色至褐色、光滑

防引起外耳道、肺和脓皮症样曲霉

其他霉菌

土曲霉菌落

杂色曲霉菌落

构巢曲霉菌落

4.微生物检验

(1)显微镜检查

①透明胶带法

可有效的保持菌落的生长形态，便于观察真菌的产泡子结构

及着生方式和袍子的排列方式。制片的过程应在生物安全柜中进

行，疑为二相真菌，除弛子丝菌外不可采用此法。

在显微镜下的特征性表现：

可见较多的分生袍子头，顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小

梗，小梗上有许多小分生电子，透明二叉分支形(分枝呈45。

角)

有隔菌丝

黄曲霉菌

烟曲霉菌

黑曲霉菌

②乳酸酚棉蓝染色法

(2)抗原、抗体的检测：

包括抗原、抗体及代谢产物检测

防抗原检测：抑制性ELISA患者血清中的曲霉菌抗原，如

GM试验

防抗体检测：检测患者血清中抗曲霉抗体，常用免疫扩散，

对流免疫、ELISA、放射、间接荧光等

由代谢产物：G试验检测细胞壁成分1-3-B-D甘露聚糖

G试验检+GM试验可提高曲霉的检出率

GM试验(Galactomannan)

一一目前国际公认的曲霉菌的诊断方法

GM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感

染的早期诊断。曲霉菌特有的细胞壁多糖成分是B(1-5)陕喃

半乳糖残基，菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释

放，是最早释放的抗原。GM释放量与菌量成正比，可以反映感

染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测。在造血干细胞移

植患者中的诊断敏感性高。

一步法酶免夹心微孔板方法检测人血清中的半乳甘露聚糖，

采用鼠EBA-2单克隆抗体，直接和曲霉菌半乳甘露聚糖结合。

将鼠EBA-2单克隆抗体微孔板并结合抗原，且检测结合到

已激活微孔板(结合物试剂：过氧化物酶连接的单克隆抗体)上

的抗原。将已经过加热处理(以便去除免疫复合物和沉淀可能干

扰实验的血清蛋白质)的EDTA血清样本加入孔中。孵育——洗

板加底物(显蓝色)加入酸溶液终止反应(蓝色变黄

色)——比色(450nm和620/630nm波长的分光光度计(酶标

仪)测定样本和对照的吸光度(光密度))

4以下情况可出现假阳性：

(1)使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他嘎巴坦；

(2)新生儿和儿童；

(3)血液透析；

(4)自身免疫性肝炎等；

(5)食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米

等。

射以下情况可出现假阴性：

(1)释放入血循环中的曲霉GM(包括甘露聚糖)并不持续

存在而是会很快清除；

(2)以前使用了抗真菌药物；

(3)病情不严重；

(4)非粒细胞缺乏的患

囤

案例分析

患者胡某，男，21岁，因“骑车摔伤致胸腹部、腰部疼痛4

小时”入院。

该病人基本特征如下：

1.患者为男性青年，既往体健。否认“肝炎”、“结核”病

史，否认“糖尿病”、“冠心病”病史，否认食物、药物过敏